Vai trò của đệm ly giải trong chiết tách DNA quan trọng ra sao?

Đệm ly giải là gì?

Chiết tách DNA là một quy trình quan trọng để tách DNA ra khỏi tế bào. Đây là một kỹ thuật phức tạp nhưng nhạy, đòi hỏi kiến thức về xử lý mẫu DNA. Quy trình này bao gồm nhiều bước, được điều chỉnh bởi các phương pháp hóa học, cơ học và enzyme. Các bước chính trong quá trình chiết tách DNA bao gồm phá vỡ thành tế bào hay màng tế bào và màng nhân, ổn định DNA, thu thập DNA và tái tạo độ ẩm cho DNA. Tỷ lệ thành công của quá trình chiết tách DNA phụ thuộc rất nhiều vào bước khởi đầu phá vỡ thành tế bào hoặc màng tế bào.

Trong bước phá vỡ thành tế bào/màng tế bào và màng nhân, lớp ngoài của tế bào cũng như màng nhân bị phá vỡ và loại bỏ bằng các kỹ thuật đã đề cập. Đệm ly giải là một hỗn hợp hóa học được sử dụng cho mục đích này, ly giải thành tế bào hoặc màng tế bào.

Đệm ly giải là một dung dịch được chuẩn bị từ nhiều hóa chất khác nhau, được sử dụng trong sinh học phân tử và tế bào để phá vỡ hoặc làm vỡ thành tế bào hoặc màng tế bào, từ đó giải phóng các thành phần tế bào. Nó được sử dụng để tách axit nucleic, protein và các phân tử khác từ tế bào.

Trong chiết tách DNA, đệm ly giải tế bào được chuẩn bị đặc biệt và sử dụng để chỉ tách DNA từ tế bào. Đây là một phương pháp ly giải hóa học sử dụng nhiều hóa chất để phá vỡ thành tế bào hay màng tế bào, ổn định và hòa tan DNA.

Tìm hiểu thêm về Tách chiết DNA tại đây: Tại Sao Phải Tách Chiết DNA Trước Khi Dùng Máy PCR?

Đệm ly giải còn được gọi là đệm ly giải tế bào, đệm ly giải chiết tách DNA hoặc đệm chiết tách DNA. Thành phần của đệm ly giải thay đổi tùy thuộc vào ứng dụng cụ thể và phương pháp chiết tách DNA.

Ví dụ như thành phần đệm ly giải cho chiết tách DNA từ máu gần như khác với chiết tách DNA từ thực vật. Tuy nhiên, nền tảng hóa học cơ bản vẫn giữ nguyên.

Thành phần của đệm ly giải

Các hóa chất phổ biến trong đệm ly giải bao gồm chất tẩy, chất đệm, muối, chất ức chế protease và chất ổn định DNA.

Chất đệm

Chất đệm duy trì môi trường pH ổn định cho các phản ứng enzyme. Do đó, các chất đệm như Tris-HCl hoặc đệm phosphate được thêm vào đệm ly giải để duy trì phạm vi pH ổn định.

Chất tẩy

Chất tẩy là một thành phần quan trọng của đệm ly giải tế bào. Tế bào chứa một lớp lipid kép. Chất tẩy có thể phá vỡ lớp này, hòa tan nó và giải phóng các thành phần tế bào vào dung dịch. SDS, Triton X-100, Tween 20 và CTAB là những chất tẩy phổ biến được sử dụng trong đệm ly giải tế bào.

Muối

Muối có nhiều chức năng trong quá trình ly giải tế bào. Chúng ổn định DNA, bảo vệ tính toàn vẹn của DNA, bảo vệ DNA khỏi hoạt động của nuclease, duy trì cân bằng ion và ổn định dung dịch. KCl, NaCl và MgCl2 được sử dụng trong đệm ly giải chiết tách DNA cho nhiều mục đích khác nhau.

Proteinase K

Trong một số đệm ly giải, enzyme Proteinase K cũng được thêm vào riêng biệt để làm cho quá trình ly giải tế bào hiệu quả hơn. Đây là một enzyme xúc tác quá trình phân hủy protein từ tế bào và loại bỏ chúng khỏi DNA.

Cách chuẩn bị đệm ly giải

Một phương pháp chung để chuẩn bị một đệm ly giải phổ quát, bao gồm công thức để chuẩn bị đệm ly giải cho các phương pháp chiết tách DNA khác nhau.

Như đã đề cập, một đệm chiết tách DNA lý tưởng nên có muối, chất đệm, chất tẩy và chất ổn định DNA. Do đó, nên sử dụng Tris-HCl, EDTA, NaCl, MgCl2, KCl, SDS và Proteinase K. Nồng độ của từng hóa chất được đưa ra dưới đây:

• Tris-HCl: 10 đến 50mM (pH 8.0)
• EDTA: 2 đến 10mM
• NaCl: 100 đến 500mM
• SDS: 0.5% (w/v)
• MgCl2: 10mM
• KCl: 10mM

Pha loãng thể tích cuối cùng với nước cất.

Lưu ý: Nồng độ của các thành phần có thể thay đổi tùy thuộc vào nhà khoa học, nhưng thường nằm trong phạm vi này.

Đầu tiên, chuẩn bị dung dịch gốc của đệm TE bằng cách sử dụng nồng độ đã cho ở trên và điều chỉnh pH đến 8.0 bằng máy đo pH hoặc chất chỉ thị. Hãy nhớ rằng pH 8.0 là tối ưu và rất quan trọng để tách DNA hiệu quả.

Cân các hóa chất khác như MgCl2, KCl và NaCl một cách chính xác và thêm vào bình vô trùng chứa đệm Tris-EDTA, sau đó trộn đều.

Kiểm tra pH của dung dịch và pha loãng thể tích cuối cùng với nước cất. Tiệt trùng dung dịch bằng autoclave để loại bỏ tạp chất hoặc nuclease. Làm nguội ở nhiệt độ phòng và thêm 0.5% w/v SDS hoặc các muối khác theo yêu cầu.

Chuẩn bị dung dịch gốc của Proteinase K theo giao thức của nhà sản xuất và bảo quản ở 4ºC.

Bảo quản đệm ly giải ở 4ºC hoặc ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra pH trước khi sử dụng.

Đến lúc này, hãy  chuẩn bị đệm ly giải cho chiết tách DNA từ máu, thực vật, vi khuẩn và DNA plasmid cùng với công thức của chúng.

Công thức đệm ly giải cho chiết tách DNA từ máu

Chiết tách DNA từ máu là một quy trình quan trọng và thường được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu. Một minh chứng cho công thức đệm ly giải chuẩn hóa tốt cho chiết tách DNA từ máu, dựa trên kinh nghiệm phong phú trong lĩnh vực này.

Chia thành phần đệm ly giải thành hai phần để tách hiệu quả cho dung dịch 1 và dung dịch 2.

Dung dịch 1 cho tách chiết DNA từ máu

• 10mM Tris (0.061 g)
• 10mM KCl (0.186 g)
• 10mM MgCl2 (0.238 g)
• Pha loãng thể tích cuối cùng với nước cất và điều chỉnh pH từ 7.6 đến 8.0

Dung dịch 2 cho tách chiết DNA từ máu

• 10mM Tris (0.061 g)
• 10mM KCl (0.037 g)
• 10mM MgCl2 (0.048 g)
• 0.5M NaCl (1.461 g)
• 2mM EDTA (0.037 g)
• Trộn tất cả các thành phần trong nước cất vô trùng và điều chỉnh pH đến 7.6
• Tiệt trùng bằng autoclave và chờ nguội về nhiệt độ phòng.
• Thêm 0.5% SDS (0.250 g)

Công thức đệm ly giải cho chiết tách DNA từ thực vật

Thực vật có thành tế bào giàu pectin và cứng, khó ly giải. Do đó, đệm ly giải cho tách DNA từ thực vật yêu cầu một số hóa chất bổ sung để ly giải thành tế bào hiệu quả. Các hóa chất bổ sung cần thiết bao gồm CTAB, Beta-mercaptoethanol, axit ascorbic và PVP. Hãy xem công thức dưới đây:

Dung dịch A cho tách chiết DNA từ thực vật

• 2% CTAB (4.0 g)
• 100 mM Tris (pH 8.0) (20 ml)
• 20 mM EDTA (2 ml)
• 1.4 M NaCl (16.4 g)
• 4% polyvinylpyrrolidone (PVP) (8.0 g)
• 0.1% axit ascorbic (0.2 g)
• 10 mM β-mercaptoethanol (140 µL)

Dung dịch B cho tách chiết DNA từ thực vật

• 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) (20 mL)
• 50 mM EDTA (10 mL)
• 100 mM NaCl (0.12 g)
• 10 mM β-mercaptoethanol (140 µL)

Công thức đệm ly giải cho chiết tách DNA từ vi khuẩn

Vi khuẩn có thành tế bào mịn, dễ ly giải hơn so với các loại tế bào khác. Tuy nhiên, thành phần của đệm ly giải và quy trình có thể thay đổi tùy thuộc vào yêu cầu và loại vi khuẩn.

Hầu hết thời gian, một thành phần đơn giản bao gồm Tris và EDTA ở pH 8.0 có thể thực hiện tốt công việc. Hơn nữa, việc thêm các thành phần bổ sung như SDS hoặc CTAB có thể mang lại hiệu suất và độ tinh khiết tốt hơn.

Công thức 1 tách chiết DNA từ vi khuẩn

• Tris: 50mM (pH 8.0)
• EDTA: 25 mM
• SDS: 1% (w/v)

Công thức 2 tách chiết DNA từ vi khuẩn

• Tris: 100mM (pH 8.0)
• EDTA: 25mM
• NaCl: 1.5M
• CTAB: 2%

Cả hai công thức đều có thể hoạt động hiệu quả. Tuy nhiên, hãy tìm hiểu về thành phần tế bào của vi khuẩn bạn đang làm việc và chọn hóa chất phù hợp.

Công thức đệm ly giải cho chiết tách DNA plasmid

Plasmid là DNA ngoài nhiễm sắc thể của vi khuẩn, tồn tại trong bào tương. Nó thường được sử dụng trong kỹ thuật di truyền, liệu pháp gen và công nghệ DNA tái tổ hợp.

Lưu ý rằng một đệm TE đơn giản có thể cung cấp một lượng DNA plasmid tốt, tuy nhiên, khuyến nghị sử dụng bộ dụng cụ cột quay để chiết tách DNA plasmid hiệu quả hơn. Hoặc bạn có thể thử với công thức sau:

• Tris: 50mM
• EDTA: 10mM
• RNase: 100mg/ml

Vai trò quan trọng của đệm ly giải

Đệm ly giải được sử dụng trong các phương pháp chiết tách DNA khác nhau để duy trì pH, phá vỡ tế bào, tối ưu hóa hiệu suất và cải thiện chất lượng DNA. Dưới đây là một số lý do chính giải thích tại sao đệm ly giải lại quan trọng:

• Duy trì pH: Đệm ly giải chứa các thành phần giúp duy trì pH của dung dịch, cung cấp một môi trường ổn định cho các hoạt động sinh học khác nhau.
• Phá vỡ tế bào: Nó chứa các thành phần phá vỡ thành tế bào/màng tế bào và màng nhân một cách hiệu quả bằng cách phân hủy các thành phần cấu trúc và hòa tan chúng bằng xử lý hóa học.
• Loại bỏ tạp chất: Đệm ly giải giúp loại bỏ các thành phần thành tế bào, protein, enzyme và các bào quan tế bào khỏi DNA.
• Ổn định DNA: Đệm ly giải ổn định DNA bằng cách ngăn chặn sự phân hủy DNA, tách DNA khỏi các mảnh vụn tế bào khác và tách biệt nó một cách hiệu quả.
• Cải thiện hiệu suất và chất lượng DNA: Một đệm ly giải chất lượng tốt và được duy trì đúng cách có thể cải thiện đáng kể hiệu suất DNA. Điều này đạt được thông qua ly giải tế bào hiệu quả, ly giải nhân và ổn định DNA. Ly giải hiệu quả cũng ngăn chặn sự phân hủy DNA bởi enzyme, loại bỏ các protein liên kết DNA và cải thiện chất lượng DNA.
• Không gây cản trở các quy trình tiếp theo: Đệm ly giải chứa các thành phần không gây cản trở cho các quy trình tiếp theo như khuếch đại PCR, tiêu hóa giới hạn và giải trình tự DNA.

Cách tối ưu hóa đệm ly giải

• Kiểm tra pH định kỳ: Đảm bảo pH tối ưu 7.8 đến 8.0 cho chiết tách DNA. Không sử dụng đệm ngoài phạm vi pH này.
• Kiểm soát nồng độ muối: Nồng độ muối là yếu tố quan trọng để có DNA chất lượng tốt. Cân mỗi hóa chất chính xác và sử dụng nồng độ phù hợp.
• Tiệt trùng dung dịch: Tiệt trùng dung dịch bằng autoclave trước khi sử dụng. Lưu ý thêm một số thành phần như SDS riêng biệt sau khi tiệt trùng.
• Chọn chất tẩy phù hợp: Chọn chất tẩy theo yêu cầu của quy trình. Ví dụ: SDS cho chiết tách DNA từ máu, CTAB cho thực vật và vi khuẩn, Triton X-100 hoặc Tween 20 cho chất lỏng sinh học.
• Nghiên cứu tài liệu: Tìm hiểu thêm về việc sử dụng chất tẩy trong chiết tách DNA và sử dụng mỗi hóa chất một cách phù hợp.
• Kết hợp phương pháp bổ sung: Sử dụng các kỹ thuật bổ sung như nhiệt hoặc ly giải cơ học cùng với đệm ly giải chỉ khi cần thiết. Ví dụ: nhiệt cho tế bào vi khuẩn, đồng nhất và nghiền cho tế bào thực vật. Các phương pháp cơ học bổ sung có thể cải thiện đáng kể chất lượng và số lượng DNA.
• Sử dụng enzyme: Sử dụng các enzyme như Proteinase K hoặc RNase để cải thiện chất lượng DNA. Proteinase K và RNase loại bỏ protein và RNA khỏi mẫu DNA.
• Lưu ý sử dụng các enzyme riêng biệt.

Đệm ly giải trong chiết tách DNA là một thành phần quan trọng của bất kỳ phương pháp chiết tách DNA nào. Nó cung cấp sự ổn định cho DNA, phá vỡ thành tế bào, loại bỏ tạp chất và cải thiện hiệu suất cũng như chất lượng DNA. Mặc dù kết quả phụ thuộc nhiều vào chuyên môn và kinh nghiệm của người thực hiện trong lĩnh vực này.

Bài viết được tham khảo và tổng hợp tại: Lysis Buffer For DNA Extraction: Importance, Recipe and Preparation