Quy trình nhuộm Giemsa cơ bản và những lưu ý quan trọng

Nguyên Lý Của Quy Trình Nhuộm Giemsa

Thuốc nhuộm Giemsa gồm các thành phần base và acid. Methylene blue và azure B bắt màu các cấu trúc có tính acid, còn eosin bắt màu các thành phần có tính base. Khi nhuộm, các chất này sẽ bám vào tế bào theo tính chất hóa học tương ứng.

Nhân tế bào giàu DNA có tính acid nên gắn với methylene blue và azure, tạo màu tím đậm hoặc xanh tím. Ngược lại, bào tương và một số hạt granules có tính base nên gắn với eosin, tạo màu hồng nhạt hoặc đỏ cam. Nhờ đó, tiêu bản lên nhiều màu khác nhau, giúp dễ phân biệt tế bào máu và ký sinh trùng.

pH của dung dịch nhuộm cần giữ khoảng 6.8 đến 7.2. Nếu pH không đúng, màu nhuộm sẽ lệch và khó quan sát. Cụ thể như một số chi tiết như hạt Schüffner trong sốt rét có thể không hiện rõ nếu pH không phù hợp. Trước khi nhuộm, tiêu bản phải được cố định bằng methanol để bảo vệ cấu trúc tế bào và ngăn ngừa biến dạng.

Chuẩn Bị Trước Khi Thực Hiện Quy Trình Nhuộm Giemsa

Trước khi nhuộm, cần chuẩn bị đầy đủ vật tư và tiêu bản.

Vật tư cần thiết bao gồm:

• Tiêu bản máu đã dàn mỏng hoặc dàn dày, để khô tự nhiên hoàn toàn
• Cồn tuyệt đối methanol để cố định
• Thuốc nhuộm Giemsa mẹ
• Dung dịch đệm phosphate hoặc nước cất trung tính có pH khoảng 7.2
• Giá nhuộm, pipet, đũa thủy tinh, nước rửa và kính hiển vi quang học

Tiêu bản cần được đánh dấu rõ ràng thông tin bệnh nhân. Đối với máu dày dùng để phát hiện ký sinh trùng sốt rét, mẫu được dàn trong vùng nhỏ khoảng 1 đến 2 cm đường kính. Với máu mỏng dùng để quan sát hình thái tế bào, mẫu được dàn thành lớp mỏng đều với đuôi mảnh.

Các Bước Tiến Hành Nhuộm Giemsa

Quy trình nhuộm Giemsa được chia thành nhiều bước chính. Dưới đây là hướng dẫn chuẩn theo thực hành phổ biến tại các phòng xét nghiệm.

Bước 1: Cố định tiêu bản

Sau khi tiêu bản khô hoàn toàn, nhúng vào cồn tuyệt đối methanol trong khoảng 3 đến 5 phút hoặc nhỏ methanol phủ đều và để khô tự nhiên. Việc cố định giúp tế bào bám chắc vào lam kính, ngăn ngừa bong tróc và bảo toàn hình thái trong quá trình nhuộm sau này.

Bước 2: Pha chế dung dịch nhuộm

Có hai cách pha phổ biến tùy theo mục đích sử dụng.

• Nhuộm thường quy: pha 1 phần Giemsa mẹ với 9 phần dung dịch đệm hoặc nước cất, tạo dung dịch khoảng 10 phần trăm. Thời gian nhuộm thường kéo dài 15 đến 45 phút.
• Nhuộm nhanh: pha loãng hơn hoặc sử dụng nồng độ cao hơn tùy theo hướng dẫn của nhà sản xuất, thời gian rút ngắn còn 10 đến 20 phút.

Luôn kiểm tra và điều chỉnh pH dung dịch về mức 7.0 đến 7.2 trước khi sử dụng để đảm bảo màu nhuộm chuẩn.

Bước 3: Nhuộm tiêu bản

Đặt tiêu bản lên giá nhuộm nằm ngang. Phủ đều dung dịch Giemsa đã pha lên toàn bộ bề mặt tiêu bản. Thời gian nhuộm phụ thuộc vào độ dày của tiêu bản và loại nhuộm. Với máu mỏng thường nhuộm 20 đến 30 phút, máu dày có thể cần thời gian lâu hơn để thuốc thấm sâu.

Một số kỹ thuật viên áp dụng phương pháp nhuộm hai thì: đầu tiên nhỏ Giemsa mẹ nguyên chất trong 1 đến 2 phút để bắt màu nhân mạnh, sau đó rửa nhẹ và tiếp tục nhuộm với dung dịch loãng.

Bước 4: Rửa và loại bỏ thuốc thừa

Sau khi hết thời gian nhuộm, rửa nhẹ nhàng dưới dòng nước chảy chậm hoặc nước đệm để loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm thừa. Tránh rửa mạnh tay vì dễ làm trôi màu hoặc làm nhòe tiêu bản.

Bước 5: Làm khô tiêu bản

Hong khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc dùng quạt nhẹ. Tuyệt đối không lau chùi hay chà xát lên bề mặt tiêu bản để tránh làm hỏng cấu trúc tế bào.

Bước 6: Quan sát dưới kính hiển vi

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi, bắt đầu với vật kính 40x để tìm vùng quan sát tốt, sau đó chuyển sang vật kính dầu 100x. Nhân tế bào thường hiện màu tím đậm, bào tương hồng hoặc xanh nhạt tùy loại tế bào, granules bắt màu đặc trưng và ký sinh trùng sốt rét hiện rõ nhân đỏ, bào tương xanh.

Quy Trình Nhuộm Giemsa Cho Máu Dày Và Máu Mỏng

Trong chẩn đoán sốt rét, người ta thường kết hợp đồng thời cả hai loại tiêu bản máu mỏng và máu dày trên cùng một lam kính hoặc hai lam riêng biệt để tăng cả độ nhạy lẫn độ đặc hiệu của xét nghiệm.

Tiêu bản máu mỏng

bước cố định bằng methanol tuyệt đối là bắt buộc và không thể bỏ qua. Methanol giúp bảo toàn nguyên vẹn hình dạng của hồng cầu, giữ cho tế bào không bị ly giải. Nhờ đó, kỹ thuật viên có thể quan sát rõ ràng vị trí của ký sinh trùng bên trong hồng cầu bị nhiễm, hình thái nhân và bào tương của Plasmodium, cũng như các đặc điểm đặc trưng như Schüffner’s dots, Maurer’s dots hoặc các thể phân chia. Việc xác định chính xác loài ký sinh trùng (Plasmodium falciparum, vivax, ovale hay malariae) chủ yếu dựa vào tiêu bản máu mỏng này.

Tiêu bản máu dày

Người ta cố ý không cố định bằng methanol. Tiêu bản được để khô tự nhiên trong thời gian dài hơn (thường ít nhất 30 phút đến vài giờ tùy độ ẩm) trước khi nhuộm trực tiếp với dung dịch Giemsa loãng hơn. Mục đích là để hồng cầu bị ly giải trong quá trình nhuộm, giúp tập trung mật độ ký sinh trùng lên một vùng nhỏ, từ đó tăng khả năng phát hiện khi số lượng ký sinh trùng thấp. Tiêu bản máu dày rất nhạy, phù hợp để sàng lọc và ước lượng mật độ ký sinh trùng mỗi microlít máu, nhưng khó xác định loài hơn vì hồng cầu đã bị phá hủy.

Kết hợp hai loại tiêu bản giúp vừa dễ phát hiện ký sinh trùng máu dày, vừa xác định được loài máu mỏng.

Lưu Ý Khi Thực Hiện Quy Trình Nhuộm Giemsa

Để tránh sai sót, kỹ thuật viên cần chú ý một số điểm sau:

• Tiêu bản phải khô hoàn toàn trước khi cố định và nhuộm. Tiêu bản ẩm dễ gây nhòe màu hoặc bong mẫu.
• pH dung dịch đệm phải chính xác. pH quá acid hoặc kiềm sẽ làm thay đổi màu sắc, giảm khả năng phân biệt cấu trúc.
• Thời gian nhuộm cần điều chỉnh theo nhiệt độ phòng và độ dày tiêu bản. Nhuộm quá lâu gây tối màu, nhuộm quá ngắn làm màu nhạt.
• Rửa tiêu bản phải nhẹ nhàng và triệt để để tránh để lại cặn thuốc.
• Sử dụng kính hiển vi chất lượng tốt và dầu soi chuẩn để quan sát chi tiết tối đa.

Ứng Dụng Của Quy Trình Nhuộm Giemsa Trong Thực Tế

Quy trình nhuộm Giemsa được áp dụng chính trong xét nghiệm huyết đồ để phân biệt các loại bạch cầu, đánh giá hình thái hồng cầu và tiểu cầu. Đây cũng là phương pháp vàng để phát hiện và định lượng ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản máu. Ngoài ra, kỹ thuật này còn hỗ trợ phát hiện Helicobacter pylori trong sinh thiết dạ dày, quan sát tế bào trong dịch cơ thể hoặc chọc hút kim nhỏ.

Tối ưu hóa giảm thiểu gánh nặng chi phí, dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, quy trình nhuộm Giemsa vẫn là công cụ thiết yếu tại các phòng xét nghiệm từ bệnh viện lớn đến cơ sở y tế cơ sở.