Vi khuẩn Gram là gì? Cách phân loại ra sao?

Nhuộm Gram từ lâu đã trở thành một trong những kỹ thuật xét nghiệm cơ bản và được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực vi sinh học cũng như y học lâm sàng. Chỉ cần vài phút thực hiện là kỹ thuật này đã có thể giúp phân loại nhanh chóng vi khuẩn thành hai nhóm chính là Gram dương và Gram âm, dựa trên những đặc điểm cấu trúc của thành tế bào. Việc phân biệt được hai nhóm này không chỉ mang ý nghĩa về mặt phân loại học thuần túy mà còn có giá trị thực tiễn rất lớn trong công việc hàng ngày của bác sĩ và kỹ thuật viên xét nghiệm.

Nó hỗ trợ định hướng chẩn đoán nhiễm khuẩn ngay từ giai đoạn sớm, góp phần lựa chọn kháng sinh phù hợp hơn trong lúc chờ kết quả nuôi cấy, đồng thời giúp tiên lượng phần nào mức độ nguy hiểm của tác nhân gây bệnh. Hiểu rõ về định nghĩa, cơ chế, sự khác biệt giữa hai nhóm, quy trình thực hiện cũng như ý nghĩa lâm sàng của nhuộm Gram sẽ giúp việc sử dụng kỹ thuật này trở nên hiệu quả và chính xác hơn.

Vi Khuẩn Gram là gì?

Vi khuẩn Gram là cách gọi chung dùng để chỉ các loại vi khuẩn được phân loại dựa trên kết quả nhuộm Gram, một kỹ thuật nhuộm phân biệt trong vi sinh học. Thuật ngữ này không chỉ một loài vi khuẩn cụ thể mà là cách phân nhóm toàn bộ vi khuẩn thành hai loại chính gồm vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, dựa trên đặc điểm cấu trúc thành tế bào của chúng.

Cơ sở để phân loại vi khuẩn Gram nằm ở thành phần và độ dày của lớp peptidoglycan, một lớp polymer tạo nên bộ khung vững chắc cho thành tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn có lớp peptidoglycan dày và không có màng ngoài, chúng được gọi là vi khuẩn Gram dương, giữ được màu tím của thuốc nhuộm. Ngược lại, nếu vi khuẩn có lớp peptidoglycan mỏng và được bao bọc thêm bởi màng ngoài chứa lipopolysaccharide, chúng được gọi là vi khuẩn Gram âm, bị mất màu tím và bắt màu hồng hoặc đỏ.

Cách phân loại vi khuẩn Gram được sử dụng rộng rãi vì ba lý do chính. Thứ nhất, phương pháp này đơn giản và nhanh chóng, chỉ cần một tiêu bản nhuộm và kính hiển vi quang học là có thể xác định sơ bộ nhóm vi khuẩn trong vòng chưa đầy ba mươi phút. Thứ hai, kết quả phân loại phản ánh đặc điểm sinh học quan trọng, vì cấu trúc thành tế bào liên quan trực tiếp đến độc lực, khả năng gây bệnh và mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Thứ ba, phương pháp có giá trị định hướng lâm sàng rõ rệt, là cơ sở ban đầu để bác sĩ lựa chọn kháng sinh kinh nghiệm trước khi có kết quả nuôi cấy và kháng sinh đồ chính thức.

Ngoài hai nhóm chính là Gram dương và Gram âm, trong thực tế còn tồn tại một số trường hợp đặc biệt. Vi khuẩn Gram variable cho kết quả nhuộm không ổn định, khi thì bắt màu tím, khi thì bắt màu hồng, thường gặp ở vi khuẩn già hoặc đang trong giai đoạn chết. Bên cạnh đó còn có những vi khuẩn không bắt màu Gram điển hình, chẳng hạn Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao) có lớp vỏ sáp đặc biệt nên cần nhuộm bằng phương pháp Ziehl Neelsen thay vì nhuộm Gram thông thường, hay Mycoplasma là vi khuẩn không có thành tế bào nên hoàn toàn không thể nhuộm Gram.

Nhìn chung, khi nhắc đến vi khuẩn Gram, người ta thường muốn nói đến hệ thống phân loại vi khuẩn dựa trên đặc tính bắt màu thuốc nhuộm Gram, một trong những nền tảng cơ bản nhất của vi sinh học lâm sàng hiện đại.

Cơ chế nhuộm Gram Tại sao vi khuẩn bắt màu khác nhau?

Sự khác biệt về màu sắc sau nhuộm Gram bắt nguồn từ cấu trúc lớp peptidoglycan trong thành tế bào vi khuẩn. Peptidoglycan là một mạng lưới polymer gồm các chuỗi đường và axit amin, tạo nên độ cứng chắc cho thành tế bào.

Quy trình nhuộm Gram sử dụng 4 loại hóa chất chính, theo đúng trình tự:

1. Crystal violet (tím Gentian): thuốc nhuộm chính, nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím.
2. Dung dịch Lugol (iodine): đóng vai trò là chất cố định màu, tạo phức hợp crystal violet iodine bên trong tế bào.
3. Dung dịch tẩy màu (cồn hoặc acetone): đây là bước quyết định, làm mất màu tím ở vi khuẩn Gram âm nhưng không ảnh hưởng đến vi khuẩn Gram dương.
4. Safranin (hoặc fuchsin): thuốc nhuộm bổ sung, nhuộm hồng/đỏ cho các tế bào đã bị mất màu tím ở bước trên.

Cơ chế giữ màu:

Sự khác biệt về màu sắc sau khi nhuộm Gram bắt nguồn từ cấu trúc thành tế bào của hai nhóm vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương sở hữu lớp peptidoglycan dày với nhiều lớp chồng lên nhau. Khi tiếp xúc với cồn hoặc acetone, lớp peptidoglycan này sẽ co lại và giữ chặt phức hợp crystal violet iodine bên trong tế bào, nhờ đó vi khuẩn vẫn giữ được màu tím.

Ngược lại, vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn nhiều và được bao bọc thêm bởi một lớp màng ngoài chứa lipid. Cồn hoặc acetone sẽ hòa tan lớp màng ngoài này, khiến phức hợp tím iodine dễ dàng thoát ra ngoài. Kết quả là tế bào mất màu tím và sau đó bắt lấy màu hồng hoặc đỏ của thuốc nhuộm bổ sung safranin.

Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại dầu một nghìn lần, người ta sẽ thấy vi khuẩn Gram dương hiện lên với màu tím hoặc xanh tím, trong khi vi khuẩn Gram âm mang màu hồng hoặc đỏ đặc trưng.

Vi khuẩn Gram dương

Vi khuẩn Gram dương là nhóm vi khuẩn có lớp peptidoglycan dày (chiếm tới 90% khối lượng thành tế bào), không có màng ngoài, nên giữ được phức hợp thuốc nhuộm tím sau bước tẩy màu.

Đặc điểm nhận biết:

• Màu sắc sau nhuộm Gram: tím hoặc xanh tím đậm.
• Thành tế bào dày, chứa axit teichoic một thành phần đặc trưng chỉ có ở vi khuẩn Gram dương.
• Không có màng ngoài nên không chứa nội độc tố LPS.

Một số vi khuẩn Gram dương thường gặp:

• Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) gây nhiễm trùng da, mô mềm, nhiễm khuẩn huyết.
• Streptococcus pneumoniae (phế cầu) nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi, viêm màng não.
• Clostridium spp. (bao gồm C. difficile, C. tetani) gây ngộ độc, uốn ván, viêm đại tràng giả mạc.
• Listeria monocytogenes gây nhiễm khuẩn qua thực phẩm, nguy hiểm với phụ nữ mang thai.

Về độ nhạy cảm kháng sinh: nhìn chung vi khuẩn Gram dương thường nhạy với nhóm kháng sinh beta lactam (penicillin, amoxicillin) do lớp peptidoglycan dày dễ bị tấn công trực tiếp.

Để hiểu thêm chi tiết về vi khuẩn gram dương, bạn có thể tham khảo bài viết này: Vi khuẩn Gram Dương có đặc điểm và phân loại ra sao trong nhuộm gram?

Vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng, được bao bọc thêm bởi một lớp màng ngoài chứa lipopolysaccharide (LPS). Chính cấu trúc màng ngoài này khiến phức hợp thuốc nhuộm dễ bị rửa trôi trong bước tẩy màu.

Đặc điểm nhận biết:

• Màu sắc sau nhuộm Gram: hồng hoặc đỏ.
• Có màng ngoài chứa LPS (nội độc tố), khoang chu chất (periplasmic space) nằm giữa màng trong và màng ngoài.
• Không chứa axit teichoic.

Một số vi khuẩn Gram âm thường gặp:

• Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn đường ruột, gây nhiễm khuẩn tiết niệu, tiêu chảy.
• Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh) nguyên nhân gây nhiễm khuẩn tại bệnh viện, kháng thuốc mạnh.
• Neisseria spp. (bao gồm N. gonorrhoeae, N. meningitidis) nguyên nhân gây lậu, viêm màng não mủ.
• Salmonella, Klebsiella pneumoniae tác nhân gây nhiễm khuẩn tiêu hóa, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết.

Về độc lực và kháng thuốc: nhờ màng ngoài bảo vệ, vi khuẩn Gram âm thường đề kháng kháng sinh tốt hơn, khó điều trị hơn, đồng thời LPS trong màng ngoài có thể gây sốc nhiễm khuẩn (septic shock) khi vi khuẩn bị ly giải.

Chi tiết về vi khuẩn gram âm xem tại đây: Vi khuẩn Gram âm đặc điểm cấu trúc và ý nghĩa lâm sàng trong nhuộm Gram

Bảng so sánh vi khuẩn Gram dương và Gram âm

Tiêu chí	Vi khuẩn Gram dương	Vi khuẩn Gram âm
Độ dày peptidoglycan	Dày (nhiều lớp)	Mỏng (1 dến 2 lớp)
Màng ngoài	Không có	Có (chứa LPS)
Axit teichoic	Có	Không có
Màu sau nhuộm Gram	Tím / xanh tím	Hồng / đỏ
Nội độc tố (LPS)	Không có	Có
Độ nhạy cảm kháng sinh	Thường nhạy với beta lactam	Thường đề kháng cao hơn
Ví dụ điển hình	S. aureus, S. pneumoniae, Clostridium	E. coli, P. aeruginosa, Salmonella
Ý nghĩa lâm sàng	Gợi ý nhóm kháng sinh phổ hẹp	Cần cân nhắc kháng sinh phổ rộng, nguy cơ sốc nhiễm khuẩn

Bài viết chi tiết về so sánh tại đây: Gram âm gram dương khác nhau thế nào? Làm sao phân biệt?

Quy trình nhuộm Vi Khuẩn Gram chi tiết từng bước

Bước 1 Chuẩn bị và cố định tiêu bản
Phết mẫu bệnh phẩm (hoặc khuẩn lạc) lên lam kính thành lớp mỏng, để khô tự nhiên, sau đó cố định bằng nhiệt (hơ nhẹ qua ngọn lửa) hoặc cố định hóa học bằng methanol.

Bước 2 Nhuộm crystal violet
Nhỏ dung dịch crystal violet phủ kín tiêu bản, để khoảng 30 đến 60 giây, rửa nhẹ bằng nước.

Bước 3 Cố định màu bằng Lugol
Nhỏ dung dịch Lugol (iodine), giữ khoảng 30 đến 60 giây, rửa nước.

Bước 4 Tẩy màu bằng cồn/acetone
Đây là bước quan trọng nhất, nhỏ từng giọt cồn 95° hoặc hỗn hợp cồn acetone cho đến khi không còn màu tím chảy ra (thường 10–20 giây). Tẩy màu quá lâu hoặc quá ngắn đều có thể cho kết quả sai lệch.

Bước 5 Nhuộm bổ sung bằng safranin
Nhỏ safranin (hoặc fuchsin kiềm), giữ khoảng 30 đến 60 giây, rửa nước và để khô.

Bước 6 Quan sát dưới kính hiển vi
Soi tiêu bản dưới vật kính dầu x100, ghi nhận: màu sắc tím  Gram dương, hồng hoặc đỏ Gram âm, hình thái như cầu khuẩn, trực khuẩn… và cách sắp xếp chuỗi, chùm, đôi…

Lưu ý kỹ thuật: bước tẩy màu là công đoạn dễ gây sai số nhất; tẩy quá tay có thể khiến vi khuẩn Gram dương bị nhận nhầm thành Gram âm, và ngược lại nếu tẩy chưa đủ.

Ý nghĩa lâm sàng của phân loại vi khuẩn Gram

Trong thực hành lâm sàng, nhuộm Gram đóng vai trò:

• Chẩn đoán nhanh sơ bộ: cho kết quả trong 15 đến 20 phút, giúp bác sĩ có định hướng ban đầu trước khi có kết quả nuôi cấy thường mất 24 đến 72 giờ.
• Định hướng điều trị kháng sinh kinh nghiệm: dựa vào việc mẫu bệnh phẩm nhiễm vi khuẩn Gram dương hay Gram âm, bác sĩ có thể lựa chọn phác đồ kháng sinh phù hợp trong khi chờ kháng sinh đồ.
• Phân biệt nhiễm khuẩn với các nguyên nhân khác: ví dụ phân biệt viêm màng não do vi khuẩn với viêm màng não do virus dựa trên đặc điểm dịch não tủy và kết quả nhuộm Gram.
• Đánh giá chất lượng mẫu bệnh phẩm: ví dụ trong mẫu đờm, sự hiện diện của nhiều bạch cầu và ít tế bào biểu mô cho thấy mẫu đạt chất lượng để nuôi cấy.

Lưu ý và hạn chế khi thực hiện nhuộm Gram

Lỗi kỹ thuật thường gặp: tẩy màu quá mức khiến vi khuẩn Gram dương bị đọc nhầm thành Gram âm; cố định nhiệt quá lâu làm biến dạng hình thái tế bào; phết mẫu quá dày gây khó quan sát.

Vi khuẩn Gram variable: một số loài như Bacillus, Clostridium ở giai đoạn già có thể cho kết quả không ổn định, lúc tím lúc hồng tùy giai đoạn phát triển.

Không thay thế được nuôi cấy định danh: nhuộm Gram chỉ mang tính định hướng, không xác định được chính xác loài vi khuẩn hay độ nhạy cảm kháng sinh cụ thể. Cần kết hợp nuôi cấy, kháng sinh đồ hoặc các xét nghiệm sinh học phân tử PCR, giải trình tự để có chẩn đoán chính xác.

Một số vi khuẩn không bắt màu Gram điển hình: ví dụ Mycobacterium trực khuẩn lao cần nhuộm Ziehl Neelsen nhuộm kháng cồn axit thay vì nhuộm Gram thông thường.

Xem thêm về: Phương pháp nhuộm gram có bao nhiêu loại và ưu điểm ra sao

Câu hỏi thường gặp về vi khuẩn gram

Vi khuẩn Gram dương màu gì? Gram âm màu gì?
Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím (hoặc xanh tím), trong khi vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng hoặc đỏ sau khi nhuộm Gram hoàn chỉnh.

Tại sao vi khuẩn Gram dương thường nhạy cảm với kháng sinh hơn?
Do lớp peptidoglycan dày, không có màng ngoài bảo vệ nên các kháng sinh nhóm beta lactam dễ dàng xâm nhập và ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào.

Nhuộm Gram có chính xác 100% không?
Không. Kết quả phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật thực hiện, đặc biệt là bước tẩy màu, và một số vi khuẩn có đặc tính Gram variable hoặc không bắt màu Gram điển hình.

Khi nào bác sĩ chỉ định nhuộm Gram?
Thường được chỉ định khi nghi ngờ nhiễm khuẩn cần xác định nhanh nhóm vi khuẩn gây bệnh, như trong nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương, dịch mủ…

Sự khác nhau quan trọng nhất giữa Gram dương và Gram âm là gì?
Khác biệt cốt lõi nằm ở cấu trúc thành tế bào: Gram dương có lớp peptidoglycan dày và không có màng ngoài, còn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng nhưng được bao bọc bởi màng ngoài chứa lipopolysaccharide LPS đây được xem là yếu tố quyết định sự khác biệt về màu nhuộm, độc lực và khả năng đề kháng kháng sinh.

Kết luận

Phân loại vi khuẩn thông qua kỹ thuật nhuộm Gram vẫn được xem là một công cụ nền tảng, dù đơn giản nhưng lại mang lại giá trị rất lớn trong công tác chẩn đoán và điều trị nhiễm khuẩn.

Việc nắm rõ sự khác biệt giữa hai nhóm Gram dương và Gram âm giúp bác sĩ định hướng lựa chọn kháng sinh hợp lý ngay từ giai đoạn đầu, từ đó góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và hạn chế phần nào tình trạng kháng thuốc ngày càng phổ biến. Tuy nhiên cần phải nhấn mạnh rằng nhuộm Gram chỉ đóng vai trò sàng lọc ban đầu.

Nó không thể thay thế hoàn toàn cho các bước nuôi cấy định danh cũng như kháng sinh đồ. Khi kết quả xét nghiệm có dấu hiệu bất thường, người bệnh nên trao đổi trực tiếp với bác sĩ chuyên khoa để được chẩn đoán và hướng dẫn điều trị một cách chính xác, phù hợp với tình trạng cụ thể của mình.