Những thành phần trong phản ứng PCR và Real Time PCR

Thành Phần Phản Ứng PCR Là Gì?

Thành phần phản ứng PCR là tập hợp các chất cần thiết để thực hiện kỹ thuật chuỗi polymerase PCR, một phương pháp khuếch đại DNA được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử đặc biệt là máy PCR.

Tìm hiểu thêm về: Máy PCR Chẩn đoán nhanh trong sinh học phân tử

Các thành phần này bao gồm DNA khuôn mẫu, mồi (primer), nucleotide (dNTPs), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm, ion Mg²⁺, và nước khử ion.

Đối với real time PCR, cần bổ sung thêm đầu dò huỳnh quang hoặc chất phát quang như SYBR Green để theo dõi quá trình khuếch đại theo thời gian thực.

Mỗi thành phần đóng vai trò quan trọng, đảm bảo phản ứng diễn ra hiệu quả và đặc hiệu, từ việc tổng hợp DNA mới đến ổn định môi trường phản ứng.

Thành phần phản ứng PCR cơ bản

Phản ứng PCR cơ bản cần các thành phần sau để khuếch đại DNA mục tiêu:

DNA khuôn mẫu (Template DNA):

DNA chứa trình tự mục tiêu cần khuếch đại, có thể chiết xuất từ động vật, thực vật, vi khuẩn, hoặc các nguồn khác. DNA cần đảm bảo chất lượng tốt, không chứa chất ức chế enzyme. Trong một số trường hợp, đặc biệt với vi khuẩn, có thể đun sôi mẫu để giải phóng DNA mà không cần tinh sạch.

Mồi (Primer):

Gồm hai loại: mồi xuôi (forward) và mồi ngược (reverse), dài từ 15-30 nucleotide, được thiết kế đặc hiệu cho hai đầu trình tự DNA mục tiêu. Nhiệt độ nóng chảy của mồi phụ thuộc vào chiều dài và tỷ lệ G-C. Mồi cần được thiết kế cẩn thận để đảm bảo độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại.

Nucleotide (dNTPs):

Bao gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP, là nguyên liệu để tổng hợp chuỗi DNA mới. Nồng độ dNTPs thường từ 20-200 μM, được bảo quản ở pH 7.0, nồng độ 10 mM.

Enzyme DNA Polymerase:

Thường sử dụng Taq polymerase, một enzyme chịu nhiệt, hoạt động tối ưu ở 72°C, tổng hợp DNA theo hướng 5’→3’. Enzyme này giữ được hoạt tính ở nhiệt độ cao (lên đến 95°C) trong quá trình biến tính DNA. Nồng độ enzyme thường là 1 unit/phản ứng.

Dung dịch đệm (Buffer):

Cung cấp môi trường tối ưu cho hoạt động của enzyme, DNA, và nucleotide. Dung dịch đệm thường chứa:

• 500 mM KCl
• 100 mM Tris-HCl (pH 8.3)
• Chất hoạt động bề mặt như Triton X-100 hoặc Tween.

Dung dịch này giúp ổn định lực ion và cấu trúc DNA.

Ion Mg²⁺ (Magnesium Chloride – MgCl₂):

Là đồng yếu tố quan trọng cho hoạt động của Taq polymerase. Nồng độ Mg²⁺ thường dao động từ 0.5-3.5 mM. Nếu nồng độ quá thấp, enzyme không hoạt động; nếu quá cao, phản ứng có thể kém đặc hiệu.

Nước khử ion (Nuclease-free water):

Đảm bảo môi trường phản ứng không bị nhiễm nuclease, dùng để pha loãng các thành phần.

Lưu ý khi chuẩn bị thành phần phản ứng PCR:

• Nồng độ Mg²⁺ và chất lượng DNA khuôn mẫu ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng PCR.
• DNA khuôn mẫu nên được thêm vào cuối cùng khi trộn các thành phần để tránh nhiễm bẩn.

Thành Phần Phản Ứng Real time PCR

Realtime PCR là một sự nâng cấp đặc biệt của PCR, cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA theo thời gian thực nhờ sử dụng các chất phát quang. Các thành phần của realtime PCR bao gồm:

Nước cất (Nuclease-free water):

Tương tự PCR thông thường, đảm bảo môi trường phản ứng sạch.

Dung dịch đệm (Buffer):

Thường chứa KCl hoặc Tris-HCl để duy trì môi trường ổn định.

Ion Mg²⁺:

Hỗ trợ hoạt động của enzyme, với nồng độ tối ưu tương tự PCR thông thường.

Enzyme Taq Polymerase:

Xúc tác quá trình tổng hợp DNA, tương tự như trong PCR thông thường.

dNTPs:

Nguyên liệu để tổng hợp chuỗi DNA mới, với nồng độ tương tự.

Mồi (Primer):

Gồm mồi xuôi và mồi ngược, được thiết kế đặc hiệu cho đoạn gene mục tiêu.

Đầu dò huỳnh quang (Probe) hoặc chất phát quang (SYBR Green):

Đây là thành phần đặc trưng của realtime PCR, giúp phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại.

• Đầu dò huỳnh quang:
  Gắn vào DNA khuôn mẫu, phát tín hiệu huỳnh quang khi khuếch đại.
• SYBR Green:
  Liên kết với DNA sợi kép, phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng DNA được khuếch đại.

DNA, cDNA hoặc RNA khuôn mẫu:

Tùy thuộc vào loại realtime PCR (DNA-based hoặc RT-PCR), khuôn mẫu có thể là DNA, cDNA (từ RNA qua quá trình phiên mã ngược), hoặc RNA.

Cách Chuẩn Bị Các Thành Phần Phản Ứng PCR và Realtime PCR

Chuẩn bị dành cho PCR

Có hai cách chính để trộn các thành phần phản ứng PCR như sau:

Cách 1: Trộn từng thành phần đơn lẻ

• Trộn các thành phần theo thứ tự: nước, dung dịch đệm, MgCl₂, dNTPs, Taq polymerase, mồi, và cuối cùng là DNA khuôn mẫu.
• Thể tích phản ứng thường từ 25-50 μL.
• Nếu thực hiện nhiều phản ứng, có thể trộn hỗn hợp lớn (nhân thể tích từng thành phần) trong ống falcon, sau đó chia nhỏ và thêm DNA khuôn mẫu.

Cách 2: Sử dụng Master Mix

• Master Mix là hỗn hợp trộn sẵn chứa Taq polymerase, dNTPs, MgCl₂, và dung dịch đệm.
• Chỉ cần thêm mồi, nước, và DNA khuôn mẫu vào Master Mix, giúp tiết kiệm thời gian và giảm sai số khi pipet.

Chuẩn bị thành phần phản ứng cho Realtime PCR

Tương tự PCR thông thường, realtime PCR có thể được chuẩn bị theo hai cách:

Cách 1: Trộn từng thành phần đơn lẻ

• Thêm lần lượt nước, dung dịch đệm, MgCl₂, dNTPs, Taq polymerase, mồi, đầu dò huỳnh quang (hoặc SYBR Green), và cuối cùng là DNA/cDNA/RNA khuôn mẫu.
• Ở lần thực hiện đầu tiên, nên tuân theo công thức chuẩn, sau đó tối ưu hóa nồng độ để cải thiện hiệu suất.

Cách 2: Sử dụng Master Mix/Supermix

• Master Mix hoặc Supermix chứa các thành phần chính (Taq polymerase, dNTPs, MgCl₂, dung dịch đệm, và đôi khi cả SYBR Green).
• Chỉ cần thêm mồi, đầu dò (nếu cần), và khuôn mẫu, giúp tiết kiệm thời gian và giảm thiểu sai số.

Lợi ích của Master Mix/Supermix:

• Phù hợp cho các phòng thí nghiệm dịch vụ hoặc bệnh viện, nơi thời gian là yếu tố quan trọng.
• Các phòng thí nghiệm nghiên cứu hoặc trường học thường sử dụng thành phần đơn lẻ để tối ưu hóa quy trình và thiết lập quy trình chuẩn.

Lưu Ý Khi Chuẩn Bị Thành Phần Phản Ứng PCR

• Độ đặc hiệu và hiệu suất: Nồng độ Mg²⁺, chất lượng DNA khuôn mẫu, và thiết kế mồi ảnh hưởng lớn đến kết quả PCR.
• Nhiệt độ và điều kiện phản ứng: Nhiệt độ nóng chảy của mồi và chu kỳ nhiệt (biến tính, gắn mồi, kéo dài) cần được tối ưu hóa.
• Tránh nhiễm bẩn: Sử dụng nước khử ion và pipet sạch để tránh nhiễm nuclease hoặc chất ức chế.
• Lựa chọn Master Mix: Đối với các ứng dụng thương mại hoặc cần xử lý nhanh, Master Mix là lựa chọn lý tưởng.

Ứng Dụng Của Phản Ứng PCR

PCR và Real Time PCR được sử dụng rộng rãi trong:

• Chẩn đoán y khoa: Phát hiện vi khuẩn, virus covid 19.
• Nghiên cứu khoa học: Phân tích gene, xác định trình tự DNA.
• Kiểm tra an toàn thực phẩm: Phát hiện vi sinh vật gây bệnh.
• Giám định pháp y: Xác định danh tính qua DNA.

Hiểu rõ thành phần phản ứng PCR và cách chuẩn bị là yếu tố then chốt để thực hiện thành công kỹ thuật PCR, từ PCR thông thường đến realtime PCR.

Việc sử dụng các thành phần chất lượng cao, tối ưu hóa nồng độ, và lựa chọn phương pháp trộn phù hợp(đơn lẻ hoặc Master Mix sẽ đảm bảo hiệu suất và độ chính xác của phản ứng.