So sánh các bước nhuộm gram thủ công và tự động

Các bước nhuộm gram thủ công

Quy trình thủ công của các bước nhuộm gram mất khoảng 5 đến 10 phút và yêu cầu thực hiện trong môi trường vô trùng để tránh ô nhiễm.

Chuẩn Bị Mẫu Preparation of the Smear

• Mô tả bước: Lấy mẫu vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy như trên đĩa thạch, dịch cơ thể nước tiểu, đờm, máu, hoặc mẫu sinh thiết bằng que cấy vô trùng. Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.9% NaCl lên lam kính sạch, dàn đều mẫu thành lớp mỏng, đều đặn. Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 25 đến 30°C trong 5-10 phút, tránh gió mạnh để ngăn ngừa ô nhiễm.
• Cố định mẫu: Hơ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn (hoặc đèn Bunsen) 2 đến 3 lần, mỗi lần khoảng 1 đến 2 giây. Mục đích là giết chết vi khuẩn, làm protein đông tụ để vi khuẩn bám chặt vào lam kính, và tăng khả năng bắt màu. Tránh hơ quá nóng để không làm biến dạng hình thái vi khuẩn.
• Giải thích khoa học: Bước này đảm bảo mẫu ổn định, ngăn vi khuẩn bị rửa trôi trong các bước sau. Nếu mẫu dày quá, có thể dẫn đến kết quả không đồng đều; nếu mỏng quá, khó quan sát.

Lưu ý: Sử dụng lam kính sạch, không dầu mỡ. Với mẫu lỏng như nước tiểu, có thể ly tâm trước để tập trung vi khuẩn.

Nhuộm Ban Đầu Bằng Crystal Violet (Primary Staining)

• Mô tả bước: Phủ dung dịch Crystal Violet tím pha lê, nồng độ 0.5 đến 1% hoặc Gentian Violet lên vùng mẫu, để yên 30 đến 60 giây. Tất cả vi khuẩn sẽ hấp thụ màu tím này.
• Rửa: Rửa nhẹ nhàng dưới vòi nước chảy chậm trong 5 đến 10 giây để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa, tránh làm trôi mẫu.
• Giải thích khoa học: Crystal Violet là thuốc nhuộm cation, liên kết với các nhóm âm điện trên thành tế bào vi khuẩn, nhuộm toàn bộ tế bào thành màu tím.

Lưu ý: Thời gian nhuộm không nên quá dài để tránh bão hòa màu, dẫn đến khó tẩy ở bước sau. Sử dụng thuốc nhuộm tươi mới để đảm bảo hiệu quả.

Cố Định Màu Bằng Dung Dịch Lugol (Mordant Application)

• Mô tả bước: Phủ dung dịch Lugol gồm iodine 1% và potassium iodide 2% lên lam kính, để 30 đến 60 giây. Dung dịch này hoạt động như chất cố định (mordant).
• Rửa: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ để loại bỏ thừa.
• Giải thích khoa học: Iodine tạo phức hợp không tan với Crystal Violet (CV-I complex), khóa màu vào thành tế bào. Ở vi khuẩn Gram dương, phức hợp này bị giữ chặt trong lớp peptidoglycan dày 20 đến 80 nm, trong khi ở Gram âm, lớp mỏng 2 đến 7 nm dễ bị tẩy.

Lưu ý: Không để quá 60 giây để tránh làm màu quá đậm, ảnh hưởng đến phân biệt.

Tẩy Màu Bằng Cồn Acetone (Decolorization)

• Mô tả bước: Phủ cồn 95% ethanol hoặc hỗn hợp acetone-ethanol tỷ lệ 1:1 lên lam kính trong 10 đến 30 giây, sau đó rửa ngay lập tức dưới vòi nước để dừng quá trình tẩy.
• Giải thích khoa học: Đây là bước quyết định, nơi cồn hòa tan lipid ở màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, làm phức hợp CV-I thoát ra, khiến chúng mất màu tím. Vi khuẩn Gram dương giữ màu nhờ lớp peptidoglycan dày và ít lipid hơn.

Lưu ý: Thời gian tẩy rất nhạy cảm – quá ngắn thì Gram âm không mất màu, quá dài thì Gram dương cũng mất màu (gọi là “decolorization error”). Với mẫu dày, cần tẩy lâu hơn; với mẫu mỏng, ngắn hơn. Kiểm soát bằng cách quan sát dòng chảy màu tím từ lam kính. Đây là lỗi thường gặp nhất, chiếm khoảng 20 đến 30% sai sót trong phòng lab.

Nhuộm Đối Chiếu Bằng Safranin Hoặc Fuchsin (Counterstaining)

• Mô tả bước: Phủ dung dịch Safranin đỏ, 0.25 đến 1% hoặc Basic Fuchsin (hồng) lên lam kính, để 40 đến 60 giây, rồi rửa sạch bằng nước.
• Giải thích khoa học: Vi khuẩn Gram âm, đã mất màu tím, sẽ hấp thụ màu đỏ/hồng này. Vi khuẩn Gram dương vẫn giữ màu tím, tạo sự tương phản.

Lưu ý: Sử dụng Safranin cho kết quả rõ ràng hơn ở kính hiển vi. Tránh nhuộm quá lâu để không làm mờ màu tím của Gram dương.

Làm Khô Và Quan Sát (Drying and Observation)

• Mô tả bước: Để lam kính khô tự nhiên hoặc thấm bằng giấy thấm sạch (không chà xát). Soi dưới kính hiển vi dầu ngâm (oil immersion lens) ở độ phóng đại 1000x (vật kính 100x với dầu ngâm).
• Giải thích khoa học: Quan sát màu sắc (tím: Gram dương; đỏ/hồng: Gram âm) và hình dạng (cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn). Có thể đếm số lượng vi khuẩn và xác định các yếu tố khác như bạch cầu nếu từ mẫu bệnh phẩm.

Lưu ý: Bảo quản lam kính trong hộp kín nếu cần lưu trữ. Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi tuổi vi khuẩn (vi khuẩn già dễ Gram biến đổi) hoặc kháng sinh (làm thay đổi thành tế bào).

Các bước nhuộm gram tự động với máy nhuộm gram

Nhuộm Gram tự động sử dụng máy nhuộm hiện đại (như các thiết bị vi sinh chuyên dụng) giúp đơn giản hóa quy trình, tăng độ chính xác và hiệu quả, đặc biệt khi xử lý số lượng lớn mẫu.

Quy trình này mất khoảng 7 đến 15 phút tùy số lượng lam và phù hợp với các phòng thí nghiệm bận rộn.

Chuẩn Bị Mẫu

Mô tả bước:

1. Tương tự thủ công: Lấy mẫu vi khuẩn bằng que cấy vô trùng, dàn mỏng trên lam kính với nước muối sinh lý (0.9% NaCl), để khô tự nhiên 5 đến 10 phút.
2. Cố định bằng cách hơ lam qua ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần mỗi lần 1 đến 2 giây.
3. Đặt lam vào khay riêng của máy xử lý 1 đến 20 lam cùng lúc.

Lưu ý:

• Đảm bảo lam kính sạch, mẫu đồng đều.
• Cố định đúng cách để tránh trôi mẫu trong máy.
• Thời gian: 5 đến 10 phút thủ công.

Đặt Lam Vào Máy Và Cài Đặt Giao Thức

Mô tả bước:

1. Đặt lam vào khay của máy nhuộm tự động.
2. Cài đặt giao thức nhuộm Gram, bao gồm các bước: Crystal Violet, Lugol, tẩy màu, Safranin, với thời gian được lập trình sẵn.

Lưu ý:

• Kiểm tra bình chứa thuốc nhuộm (Crystal Violet, Gram Iodine, Acetone Alcohol, Safranin) để đảm bảo đủ dung dịch.
• Điều chỉnh thời gian tẩy màu 10 đến 30 giây dựa trên độ dày mẫu.
• Thời gian: 1 đến 2 phút.

Chạy Quy Trình Nhuộm Tự Động

Mô tả bước:

1. Máy nhuộm gram tự động thực hiện:
2. Nhuộm Crystal Violet: Phun dung dịch Crystal Violet 0.5 đến 1%, để 30 đến 60 giây, rửa bằng nước cất.
3. Cố định bằng Lugol: Phun Gram Iodine, để 30 đến 60 giây, rửa sạch.
4. Tẩy màu: Phun hỗn hợp Acetone Alcohol 10 đến 30 giây, rửa ngay để dừng tẩy.
5. Nhuộm Safranin: Phun Safranin 0.25 đến 1% hoặc Fuchsin, để 40 đến 60 giây, rửa sạch.
6. Máy kiểm soát chính xác thời gian và lượng thuốc, đảm bảo vi khuẩn Gram dương giữ màu tím, Gram âm bắt màu đỏ/hồng. Bước tẩy màu được tối ưu để giảm lỗi (lỗi tẩy màu chiếm 20 đến 30% trong thủ công).

Lưu ý:

• Sử dụng thuốc nhuộm tươi, đúng nồng độ.
• Kiểm tra hệ thống phun để tránh tắc nghẽn.
• Thời gian: 5 đến 10 phút tùy số lượng lam.

Làm Khô Lam

Mô tả bước:

1. Máy làm khô lam bằng cách quay ở tốc độ cao tầm ~300 rpm, loại bỏ nước thừa.
2. Giải thích khoa học: Làm khô nhanh giúp lam sạch, sẵn sàng quan sát, tránh vết nước ảnh hưởng đến hình ảnh hiển vi.

Lưu ý:

• Kiểm tra lam sau khi làm khô để đảm bảo không trầy xước.
• Thời gian: 1 đến 2 phút.

Quan Sát Dưới Kính Hiển Vi

Mô tả bước:

1. Lấy lam ra, soi dưới kính hiển vi dầu ngâm 1000x để quan sát màu sắc (tím sẽ là Gram dương và ngược lại đỏ hay hồng sẽ là Gram âm và hình dạng vi khuẩn.
2. Giải thích khoa học: Kết quả tương tự thủ công, nhưng máy đảm bảo màu sắc đồng đều hơn nhờ kiểm soát chính xác.

Lưu ý:

• Lưu trữ lam trong hộp kín.
• Chú ý vi khuẩn già hoặc tác động của kháng sinh có thể gây kết quả không điển hình.
• Thời gian: 2 đến 5 phút.

So sánh các bước nhuộm gram giữa thủ công và tự động

Tiêu chí	Thủ Công	Tự Động
Thời gian	5 đến 10 phút/lam, lâu hơn nếu nhiều lam.	7 đến 15 phút cho 1 đến 20 lam.
Độ chính xác	Dễ sai sót ở bước tẩy màu 20 đến 30% lỗi.	Kiểm soát thời gian và thuốc, giảm lỗi.
Ngăn nhiễm chéo	Nguy cơ cao nếu không vô trùng.	Khay riêng, thuốc tươi, giảm nhiễm chéo.
Chi phí	Thấp, chỉ cần lam và thuốc nhuộm.	Cao máy, bảo trì, thuốc chuyên dụng.
Số lượng mẫu	Phù hợp số lượng nhỏ.	Lý tưởng cho số lượng lớn 1 đến 20 lam.
Yêu cầu kỹ thuật	Phụ thuộc tay nghề.	Dễ sử dụng, ít phụ thuộc kỹ năng sau cài đặt.

Lợi Ích của Nhuộm Gram Tự Động

• Hiệu quả: Xử lý nhiều lam cùng lúc, tiết kiệm thời gian.
• Chính xác: Giảm lỗi tẩy màu nhờ kiểm soát thời gian và lượng thuốc.
• Ngăn nhiễm chéo: Khay riêng và thuốc tươi đảm bảo kết quả sạch.
• Ứng dụng: Phù hợp cho phòng thí nghiệm lớn, hỗ trợ chẩn đoán nhanh (nước tiểu, đờm).

Tìm hiểu thêm về: Tìm hiểu về kỹ thuật nhuộm gram tự động

Nhuộm Gram là kỹ thuật không thể thiếu trong vi sinh học, với cả hai phương pháp thủ công và tự động đều có ưu điểm riêng. Phương pháp thủ công chi phí thấp, linh hoạt, nhưng dễ sai sót và tốn thời gian. Nhuộm Gram tự động với máy Dagatron AT1000 hiện đại sẽ đảm bảo độ chính xác, đồng đều, và hiệu quả cao, đặc biệt khi xử lý số lượng lớn mẫu. Tùy nhu cầu và điều kiện phòng thí nghiệm, bạn có thể chọn phương pháp phù hợp để phân biệt vi khuẩn hiệu quả.