English
Thiết bị phòng thí nghiệm
Kỹ thuật nhuộm gram trong xét nghiệm vi sinh
Giới thiệu về kỹ thuật nhuộm Gram
Kỹ thuật nhuộm gram là một trong những phương pháp nhuộm vi khuẩn cơ bản và quan trọng nhất trong vi sinh học y học. Kỹ thuật nhuộm gram giúp phân biệt nhanh chóng hai nhóm vi khuẩn chính: vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím) và vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ/hồng). Kết quả nhuộm Gram hỗ trợ chẩn đoán nhiễm khuẩn, định hướng điều trị kháng sinh ban đầu, và là bước sơ bộ trước khi nuôi cấy hoặc xét nghiệm phân tử.
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm phân loại vi khuẩn dựa trên đặc tính lý hóa của thành tế bào. Phương pháp này phân biệt vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím sẫm) và vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ fucshin). Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong phòng xét nghiệm vi sinh, giúp chẩn đoán nhanh các bệnh nhiễm khuẩn như viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não, và nhiều bệnh lý khác.
Nhuộm gram cần chuẩn bị thuốc thử và dụng cụ ra sao
Để thực hiện nhuộm Gram chuẩn, cần chuẩn bị đầy đủ như:
Thuốc thử chính: Dung dịch tím gentian. Dung dịch Lugol. Cồn tẩy 95 độ. Dung dịch đỏ fucshin pha loãng 1/10 hoặc Safranin.
Dụng cụ cần thiết: Lam kính sạch. Đèn cồn, diêm. Bút viết lam kính. Tăm bông hoặc que cấy. Nước muối sinh lý. Vòi nước chảy nhẹ. Bình đựng chất thải. Đồng hồ bấm giây. Kính hiển vi với vật kính dầu 100x.
Lưu ý: Các dung dịch thuốc nhuộm cần được lọc sạch trước khi dùng để tránh cặn gây sai kết quả.
Tham khảo các bước của kỹ thuật nhuộm Gram
Quy trình nhuộm Gram thủ công được thực hiện theo các bước sau:
- Dàn bệnh phẩm hoặc khuẩn lạc vi khuẩn lên lam kính sạch, tạo lớp mỏng đều.
- Cố định bằng cách hơ nhẹ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 đến 4 lần, để nguội hoàn toàn.
- Nhuộm: Phủ dung dịch tím gentian, để khoảng 30 giây. Rửa nhẹ dưới vòi nước chảy. Phủ dung dịch Lugol để cố định màu, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước. Tẩy màu bằng cồn 95°, để khoảng 30 giây bước quan trọng nhất, cần chính xác thời gian. Rửa nước ngay. Phủ dung dịch đỏ fucshin pha loãng 1/10, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.
- Để khô tự nhiên không lau.
- Soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu x1000.
Nguyên tắc nhuộm Gram cần biết
Quy trình diễn ra theo các giai đoạn: Nhuộm tím gentian: tất cả vi khuẩn bắt màu tím đen. Nhỏ Lugol: tạo phức hợp tinh thể tím iod gắn chặt vào thành tế bào. Tẩy cồn 95°: bước quyết định, tẩy màu ở vi khuẩn có thành tế bào mỏng, không tẩy ở vi khuẩn thành dày. Nhuộm đỏ fucshin: nhuộm lại màu đỏ cho những vi khuẩn đã mất màu tím.
Bước tẩy cồn rất quan trọng, cần chú ý thời gian và kỹ thuật để tránh sai lệch.
Cơ chế bắt màu Gram
Sự khác biệt nằm ở lớp peptidoglycan trong thành tế bào vi khuẩn: Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày, giữ chặt phức hợp tím gentian iod. Cồn không tẩy được màu tím nên vi khuẩn giữ màu tím sẫm sau nhuộm fucshin. Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng, kèm lớp màng ngoài lipopolysaccharide. Cồn hòa tan lớp màng ngoài, tẩy sạch màu tím nên vi khuẩn trở thành không màu, sau đó bắt màu đỏ fucshin.
Đọc kết quả nhuộm Gram
Vi khuẩn Gram dương: màu tím sẫm, ví dụ tụ cầu, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn bạch hầu, trực khuẩn than. Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ hoặc hồng, ví dụ lậu cầu, não mô cầu, E. coli, Shigella, Salmonella, trực khuẩn tả.
Kết hợp hình dạng, cách sắp xếp đơn lẻ, chuỗi, đám để định danh sơ bộ.
Lưu ý về nguyên nhân nhuộm sai
Gram dương giả vi khuẩn Gram âm bị nhuộm thành dương: tiêu bản cố định khi chưa khô hoàn toàn, tiêu bản quá dày, cặn thuốc nhuộm không lọc, đổ chưa hết Lugol, tẩy cồn chưa đủ thời gian, fucshin quá đậm hoặc nhuộm quá lâu.
Gram âm giả vi khuẩn Gram dương bị nhuộm thành âm: không thay Lugol mới, tẩy cồn quá lâu hoặc tráng không kỹ.
Bảng kiểm tra kỹ thuật nhuộm Gram
| TT | Các bước tiến hành kỹ thuật | |
| 1 | Chuẩn bị thuốc nhuộm: tím gentian, Lugol, cồn 95°, đỏ fucshin 1/10. Dụng cụ đầy đủ. | |
| 2 | Đánh dấu lam kính (số hoặc ký hiệu bệnh phẩm, mặt trái). | |
| 3 | Dàn bệnh phẩm mỏng đều lên lam kính sạch. | |
| 4 | Cố định bằng hơ lửa đèn cồn, để nguội. | |
| 5 | Phủ tím gentian 30 giây, rửa nước. | |
| 6 | Phủ Lugol 30 giây, rửa nước. | |
| 7 | Tẩy cồn 95° 30 giây, rửa nước. | |
| 8 | Phủ fucshin 1/10 30 giây, rửa nước. | |
| 9 | Để khô tự nhiên. | |
| 10 | Soi dưới vật kính dầu (100x). |
Nhuộm Gram tự động với Dagatron và ưu điểm vượt trội so với nhuộm Gram truyền thống
Hiện nay, các phòng xét nghiệm tại Việt Nam đã bắt đầu áp dụng máy nhuộm Gram tự động như Dagatron để nâng cao hiệu quả công việc.
Máy tự động hóa toàn bộ quy trình từ phun thuốc, cố định màu, tẩy màu đến sấy khô, thường chỉ mất khoảng 6 đến 15 phút cho 10 đến 20 lam tùy model.
So với nhuộm Gram thủ công truyền thống, nhuộm Gram tự động mang lại nhiều ưu điểm nổi bật, giúp cải thiện chất lượng xét nghiệm và tối ưu hóa nguồn lực phòng lab.
- Độ chính xác và tính nhất quán cao hơn hẳn nhờ sử dụng giao thức chuẩn hóa hoàn toàn tự động.
Trong nhuộm thủ công, thời gian để thuốc nhuộm, thời gian tẩy cồn hay lượng thuốc phủ lên lam phụ thuộc vào kỹ thuật viên, dễ dẫn đến sai số giữa các lần nhuộm hoặc giữa các người thực hiện. Máy Dagatron đảm bảo mọi lam đều được xử lý theo cùng một thông số chính xác, giúp kết quả nhuộm đồng đều, dễ đọc và giảm thiểu tình trạng Gram dương giả hoặc Gram âm giả do lỗi thao tác. - Giảm đáng kể thời gian thao tác tay.
Kỹ thuật viên chỉ cần đặt lam kính vào máy, chọn chương trình và khởi động, sau đó có thể làm các công việc khác trong lúc máy chạy. Với nhuộm thủ công, mỗi bộ 10 lam có thể mất 10 đến 20 phút thao tác liên tục, trong khi máy tự động tiết kiệm đến 50% hoặc hơn thời gian lao động trực tiếp, đặc biệt hữu ích ở phòng xét nghiệm có khối lượng mẫu lớn. - Giảm thiểu nguy cơ nhiễm chéo giữa các mẫu.
Máy Dagatron sử dụng hệ thống phun riêng biệt, khay tự làm sạch bằng cồn và nước cất sau mỗi chu kỳ, cùng cơ chế không tiếp xúc trực tiếp giữa các lam, giúp loại bỏ hoàn toàn rủi ro lây nhiễm chéo mà nhuộm thủ công thường gặp khi rửa chung dưới vòi nước hoặc xử lý nhiều lam cùng lúc. - Tiết kiệm hóa chất và giảm lượng chất thải.
Hệ thống phun chính xác chỉ dùng lượng thuốc nhuộm cần thiết cho từng lam, thường tiết kiệm 30% đến 50% lượng thuốc so với nhuộm thủ công khi kỹ thuật viên dễ đổ thừa hoặc rửa trôi nhiều. Ngoài ra, lượng nước rửa và chất thải hóa học cũng giảm đáng kể nhờ cơ chế kiểm soát dòng chảy, góp phần bảo vệ môi trường và giảm chi phí xử lý chất thải nguy hại.
Thứ năm, tăng cường an toàn cho người thực hiện. Nhuộm thủ công đòi hỏi tiếp xúc trực tiếp với các hóa chất như cồn, Lugol, fucshin, có nguy cơ hít phải hơi hoặc dính da. Máy tự động Dagatron hoạt động khép kín, có cảnh báo mức thuốc thấp, tự động làm sạch, giúp kỹ thuật viên tránh tiếp xúc hóa chất và giảm nguy cơ tai nạn lao động.
Cuối cùng, máy còn hỗ trợ theo dõi và kiểm soát chất lượng tốt hơn với tính năng ghi nhận mức thuốc, cảnh báo bảo dưỡng, giúp phòng lab duy trì hiệu suất ổn định lâu dài. Nhờ những ưu điểm này, nhuộm Gram tự động Dagatron không chỉ nâng cao độ tin cậy kết quả mà còn phù hợp với xu hướng hiện đại hóa phòng xét nghiệm, đặc biệt ở các cơ sở y tế có lưu lượng bệnh phẩm cao.
Kỹ thuật nhuộm Gram vẫn là công cụ không thể thiếu trong chẩn đoán vi sinh. Việc kết hợp giữa kỹ thuật thủ công cơ bản và công nghệ tự động như Dagatron giúp đảm bảo kết quả chính xác, nhanh chóng, hỗ trợ bác sĩ điều trị hiệu quả hơn. Nếu bạn đang học hoặc làm việc trong lĩnh vực xét nghiệm y học, hãy thực hành kỹ thuật này thường xuyên và cân nhắc áp dụng thiết bị tự động để tối ưu hóa quy trình!
Xem thêm: Tìm hiểu thêm về kỹ thuật nhuộm gram tự động
