English
Thiết bị phòng thí nghiệm
Nhuộm Ziehl Neelsen là gì? Nguyên lý và kỹ thuật nhuộm ra sao?
Nhuộm Ziehl Neelsen thường viết tắt là ZN hay còn gọi là nhuộm kháng acid là kỹ thuật nhuộm vi khuẩn kinh điển trong vi sinh y học, dùng để phát hiện trực khuẩn kháng acid Acid Fast Bacilli, viết tắt AFB, điển hình nhất là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, tác nhân gây bệnh lao.
Dù hiện nay đã có GeneXpert và nuôi cấy, nhuộm Ziehl Neelsen vẫn được dùng hàng ngày ở nhiều phòng xét nghiệm. Lý do đơn giản là chi phí thấp, làm nhanh, và WHO vẫn khuyến cáo sử dụng ở những nơi chưa có điều kiện làm xét nghiệm hiện đại.
Bài viết này sẽ đi sâu vào nguyên lý, quy trình thực hiện, hóa chất cần thiết và cách đọc kết quả nhuộm Ziehl Neelsen, giúp bạn nắm vững kỹ thuật nhuộm AFB từ cơ bản đến chuyên sâu.
Lịch sử và ý nghĩa của nhuộm Ziehl Neelsen
Kỹ thuật nhuộm Ziehl Neelsen ra đời vào cuối thế kỷ 19, bắt nguồn từ nghiên cứu của Paul Ehrlich. Sau đó, hai nhà khoa học người Đức là Franz Ziehl (nhà vi khuẩn học) và Friedrich Neelsen (nhà giải phẫu bệnh) đã cải tiến và hoàn thiện thành phương pháp mang tên họ như hiện nay.
Phương pháp này còn được gọi là phương pháp nóng vì trong quá trình nhuộm, thuốc nhuộm carbol fuchsin được đun nóng để tăng khả năng xuyên thấu qua lớp vách tế bào giàu lipid của vi khuẩn Mycobacterium.
Khác với nhuộm Ziehl Neelsen, phương pháp Kinyoun không cần đun nóng mà dùng nồng độ phenol cao hơn để đạt hiệu quả tương tự. Ngoài ra còn có kỹ thuật nhuộm huỳnh quang Auramine O. Phương pháp này có độ nhạy cao hơn và soi kính nhanh hơn, nhưng cần kính hiển vi huỳnh quang chuyên dụng nên chi phí đầu tư cũng cao hơn.
Để biết thêm nhiều kỹ thuật khác bạn có thể xem thêm: Kỹ thuật nhuộm Gram trong xét nghiệm vi sinh
Nguyên lý của nhuộm Ziehl Neelsen
Vách tế bào của vi khuẩn Mycobacterium chứa rất nhiều acid mycolic một loại lipid dạng sáp. Lớp sáp này tạo thành vỏ kỵ nước dày, khiến vi khuẩn khó bắt màu bằng nhuộm Gram thông thường
Có thể bạn quan tâm: Phương pháp nhuộm gram có bao nhiêu loại
Trong nhuộm Ziehl Neelsen, thuốc nhuộm chính là carbol fuchsin (hỗn hợp phenol và basic fuchsin). Khi kết hợp với nhiệt độ cao, thuốc dễ dàng xuyên qua lớp sáp và gắn chặt vào thành tế bào vi khuẩn.
Sau khi nhuộm, tiêu bản được xử lý bằng dung dịch tẩy màu (acid alcohol hoặc H₂SO₄ 20 đến 25%). Dung dịch này chỉ tẩy được màu ở những vi khuẩn không kháng acid, còn AFB vẫn giữ nguyên màu đỏ nhờ cấu trúc vách tế bào đặc biệt.
Cuối cùng, tiêu bản được nhuộm đối bằng methylene blue hoặc malachite green để tạo nền tương phản. Khi soi kính, vi khuẩn AFB sẽ hiện lên màu đỏ hoặc hồng nổi bật trên nền xanh.
Hóa chất và dụng cụ cần thiết cho nhuộm Ziehl Neelsen
Để thực hiện nhuộm Ziehl Neelsen đạt chuẩn, cần chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ sau:
| Đặc điểm | Nhuộm Gram | Nhuộm kháng axit |
|---|---|---|
| Đối tượng vi sinh vật | Hầu hết các loại vi khuẩn | Các loài Mycobacterium và một số vi sinh vật có liên quan |
| Thuốc nhuộm chính | Crystal violet | Carbol fuchsin |
| Yếu tố phân biệt chính | Độ dày của lớp peptidoglycan | Hàm lượng acid mycolic trong thành tế bào |
| Cần gia nhiệt | Không | Có, thường sử dụng nhiệt để giúp thuốc nhuộm thấm vào thành tế bào chứa nhiều chất dạng sáp |
| Ứng dụng lâm sàng điển hình | Nhận diện và phân loại vi khuẩn nói chung | Chẩn đoán bệnh lao và các nhiễm trùng do vi khuẩn Mycobacterium liên quan |
Quy trình nhuộm Ziehl Neelsen chi tiết từng bước
Quy trình nhuộm Ziehl Neelsen chuẩn gồm các bước sau:
- Chuẩn bị tiêu bản:
Làm phết đờm mỏng và đều trên lam kính, để khô tự nhiên rồi cố định bằng nhiệt (hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần). - Nhuộm chính bằng carbol fuchsin:
Phủ carbol fuchsin lên toàn bộ tiêu bản, đun nóng nhẹ đến khi thuốc nhuộm bắt đầu bốc hơi (không để sôi), giữ trong khoảng 5 phút. - Rửa nước: Rửa nhẹ tiêu bản dưới vòi nước sạch để loại bỏ thuốc nhuộm thừa.
- Tẩy màu: Nhỏ acid alcohol hoặc H2SO4 lên tiêu bản cho đến khi tiêu bản chuyển sang màu hồng nhạt, sau đó rửa lại bằng nước.
- Nhuộm đối bằng methylene blue: Phủ methylene blue lên tiêu bản trong khoảng 1 đến 2 phút để tạo màu nền.
- Rửa, để khô và soi kính: Rửa nhẹ tiêu bản, để khô tự nhiên trong không khí rồi soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100X.
Cách đọc và báo cáo kết quả nhuộm Ziehl Neelsen
Khi soi kính, kết quả AFB dương tính được nhận diện qua hình ảnh trực khuẩn màu đỏ hoặc hồng, hình que thẳng hoặc hơi cong, đôi khi bắt màu không đều tạo hình dạng chuỗi hạt đặc trưng, nổi bật trên nền xanh của methylene blue.
Theo thang điểm đánh giá của WHO và Liên đoàn Quốc tế Chống Lao và Bệnh Phổi (IUATLD), kết quả nhuộm AFB được phân loại như sau:
| Số lượng AFB quan sát được | Kết quả báo cáo |
|---|---|
| Không thấy AFB trong 100 vi trường | Âm tính |
| 1 đến 9 AFB trong 100 vi trường | Scanty (ghi số lượng cụ thể) |
| 10 đến 99 AFB trong 100 vi trường | 1+ |
| 1 đến 10 AFB trên mỗi vi trường (kiểm tra ít nhất 50 vi trường) | 2+ |
| Trên 10 AFB trên mỗi vi trường (kiểm tra ít nhất 20 vi trường) | 3+ |
Khi đọc kết quả, cần lưu ý đến chất lượng tiêu bản (độ dày, độ đều của phết đờm) và số lượng vi trường quan sát tối thiểu để đảm bảo độ tin cậy của kết quả nhuộm Ziehl Neelsen.
Để hiểu rõ bạn có thể xem qua: Cách đọc kết quả xét nghiệm vi khuẩn nhuộm soi
Ứng dụng lâm sàng của nhuộm Ziehl Neelsen
Nhuộm Ziehl Neelsen được dùng phổ biến nhất để chẩn đoán lao phổi qua mẫu đờm. Ngoài ra, kỹ thuật này cũng hỗ trợ chẩn đoán lao ngoài phổi trên các bệnh phẩm như dịch màng phổi, dịch não tủy hoặc mô sinh thiết.
Ngoài Mycobacterium tuberculosis, kỹ thuật này còn giúp phát hiện Mycobacterium leprae (vi khuẩn gây bệnh phong), một số vi khuẩn Mycobacterium không lao (NTM) và cả một số tác nhân ký sinh trùng kháng acid như Cryptosporidium.
So với GeneXpert MTB/RIF hay nuôi cấy, nhuộm Ziehl Neelsen có ưu điểm rõ rệt: chi phí thấp, làm nhanh và không cần trang thiết bị phức tạp. Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này thấp hơn, chỉ phát hiện được khi mật độ vi khuẩn trong bệnh phẩm khá cao. Ngoài ra, nhuộm ZN cũng không phân biệt được vi khuẩn còn sống hay đã chết, và không xác định được tình trạng kháng thuốc như GeneXpert.
Lưu ý khi thực hiện và các sai sót thường gặp
Để có kết quả nhuộm Ziehl Neelsen chính xác, cần lưu ý tránh một số sai sót thường gặp sau:
- Không đun sôi thuốc nhuộm quá mức: Đun sôi quá mạnh có thể làm carbol fuchsin bốc hơi hết, gây nứt tiêu bản hoặc làm hỏng cấu trúc vi khuẩn.
- Tẩy màu không đúng mức độ: Tẩy màu quá kỹ có thể làm mất màu cả những AFB thật sự dương tính (âm tính giả), trong khi tẩy màu chưa đủ dễ gây dương tính giả do các vi khuẩn khác giữ lại màu đỏ.
- Tiêu bản phết quá dày hoặc quá mỏng: Ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng quan sát và đếm số lượng AFB chính xác.
- Không kiểm soát chất lượng: Cần luôn sử dụng tiêu bản chứng dương và chứng âm song song để đảm bảo hóa chất và quy trình nhuộm hoạt động đúng chuẩn.
Câu hỏi thường gặp về nhuộm Ziehl Neelsen
Nhuộm Ziehl Neelsen khác nhuộm Gram như thế nào?
Nhuộm Gram phân loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc vách tế bào Gram dương và Gram âm. Còn nhuộm Ziehl Neelsen chuyên dùng để phát hiện vi khuẩn kháng acid nhờ khả năng giữ màu của lớp acid mycolic, đây là điều mà nhuộm Gram không làm được với nhóm vi khuẩn này
Để dễ hiểu hơn bạn có thể xem thêm bài: Gram âm bắt màu gì trong nhuộm gram
Có thể dùng phương pháp lạnh (cold method) thay cho nhuộm Ziehl Neelsen không?
Có thể. Phương pháp Kinyoun sử dụng nồng độ phenol cao hơn và không cần đun nóng, phù hợp khi không có điều kiện làm nóng tiêu bản, tuy nhiên độ nhạy có thể thay đổi tùy vào tay nghề người thực hiện.
Độ nhạy của kỹ thuật nhuộm Ziehl Neelsen ra sao?
Độ nhạy của phương pháp này thường dao động khá rộng tùy vào chất lượng bệnh phẩm và mật độ vi khuẩn, nhìn chung thấp hơn so với nuôi cấy hoặc các kỹ thuật sinh học phân tử như GeneXpert.
Khi nào cần làm thêm xét nghiệm khác ngoài nhuộm Ziehl Neelsen?
Khi kết quả nhuộm AFB âm tính nhưng vẫn nghi ngờ lao trên lâm sàng, hoặc cần xác định tình trạng kháng thuốc, bác sĩ thường chỉ định thêm nuôi cấy vi khuẩn hoặc xét nghiệm GeneXpert MTB/RIF để có kết quả chính xác hơn.
Kết luận Nhuộm Ziehl Neelsen
Nhuộm Ziehl Neelsen vẫn là kỹ thuật nhuộm AFB kinh điển, đơn giản và chi phí thấp, nhưng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán lao phổi cũng như một số bệnh do vi khuẩn kháng acid gây ra. Nắm vững nguyên lý, quy trình và cách đọc kết quả sẽ giúp nhân viên xét nghiệm đảm bảo chất lượng chẩn đoán, hỗ trợ tốt hơn cho công tác điều trị.
Bài viết này tham khảo tại các nguồn sau:
WHO – Laboratory diagnosis of tuberculosis by sputum microscopy
Microbe Online – Ziehl-Neelsen Staining
CDC – Acid-Fast Stain Procedures
IUATLD / The Union – Technical Guide on Sputum Examination for Tuberculosis by Microscopy
