Nguyên Nhân Âm Tính Giả Trong PCR và Giải Pháp Loại Bỏ

Âm Tính Giả Trong PCR Là Gì?

Ngược lại với Dương tính giả, thì Âm tính giả trong cách test pcr xảy ra khi mẫu thực sự chứa virus SARS-CoV-2 nhưng kết quả trả về âm tính. Điều này có thể dẫn đến việc bỏ xót những ca bệnh chứa virus, điều này khiến làm chậm quá trình khoanh vùng và dập dịch. Các nguyên nhân gây âm tính giả thường liên quan đến như chất lượng mẫu không đảm bảo, thời điểm lấy mẫu sai quy trình, môi trường bảo quản không đúng cách, quy trình tách chiết, và các yếu tố kỹ thuật trong xét nghiệm

Bạn có thể tìm hiểu thêm về: Cách test PCR trong quy trình chuẩn phòng xét nghiệm

Nguyên Nhân Khiến Kết Quả Âm Tính Giả Trong PCR

1. Trước Xét Nghiệm

Chất Lượng Bệnh Phẩm Không Đạt

• Nguyên nhân là do nệnh phẩm tiêu chuẩn cho xét nghiệm PCR là dịch tỵ hầu và dịch họng, cần được lấy đúng phương pháp. Các bệnh phẩm khác như dịch rửa tỵ hầu thường có tải lượng virus thấp hơn, dẫn đến nguy cơ âm tính giả. Nếu chỉ lấy dịch họng mà không lấy dịch tỵ hầu, hoặc lấy dịch tỵ hầu không đúng vị trí giải phẫu chỉ ngoáy ở khu vực tiền đình mũi, kết quả có thể âm tính giả.
• Giải pháp giúp chất lượng bệnh phẩm đạt là đào tạo điều dưỡng viên và kỹ thuật viên lấy mẫu chuẩn xác, đảm bảo lấy đủ bệnh phẩm từ cả tỵ hầu và họng. Sử dụng kỹ thuật lấy mẫu đúng vị trí giải phẫu để đạt tải lượng virus tối ưu.

Thời Điểm Lấy Mẫu Không Phù Hợp

• Nguyên nhân không kém phần quan trọng gây âm tính giả là lấy mẫu quá sớm từ 1 đến 3 ngày sau phơi nhiễm có thể dẫn đến âm tính giả vì virus chưa nhân lên đủ lượng để phát hiện. Lấy mẫu quá muộn từ ngày 17 trở đi cũng gây âm tính giả do cơ thể đã đào thải virus. Với các trường hợp không triệu chứng, việc chọn thời điểm lấy mẫu càng quan trọng.
• Giải pháp là phải lấy mẫu ngay khi xuất hiện triệu chứng hoặc trong khoảng 5 đến 7 ngày sau phơi nhiễm đối với trường hợp không triệu chứng. Kết hợp xét nghiệm kháng thể IgM hay IgG nếu nghi ngờ âm tính giả, lưu ý rằng IgM không phải là marker đặc hiệu cho giai đoạn cấp của Covid 19 vì có thể xuất hiện muộn hơn IgG.

Môi Trường Bảo Quản và Vận Chuyển Không Đảm Bảo

• Nguyên nhân khác không thể kể đến đó chính là một số đơn vị sử dụng nước muối sinh lý hoặc PBS thay cho môi trường VTM (Viral Transport Medium là loại dung dịch được bào chế theo hướng dẫn của CDC Hoa Kỳ và WHO, dùng để bảo quản hay vận chuyển mẫu bệnh phẩm chứa virus an toàn đến phòng xét nghiệm), nhưng nếu ống đựng môi trường bị nhiễm heparin, bột găng tay, hoặc các chất ức chế PCR, phản ứng sẽ không thực hiện được, dẫn đến âm tính giả Nước muối hoặc PBS không bảo quản được virus sống, chỉ phù hợp cho PCR, trong khi VTM hỗ trợ cả nuôi cấy và phân lập virus.
• Giải pháp để hạn chế đó chính là việc sử dụng ống môi trường VTM tiêu chuẩn để bảo quản và vận chuyển mẫu. Kiểm tra kỹ ống môi trường trước khi sử dụng, đảm bảo không bị nhiễm chất ức chế.

2. Trong Quá Trình Xét Nghiệm

Gộp Mẫu Quá Nhiều

• Nguyên nhân trong quá trình xét nghiệm làm cho kết quả âm tính giả đó chính là quy định cho phép gộp 10 đến 20 mẫu trong một phản ứng PCR, nhưng việc gộp quá nhiều làm giảm thể tích tách chiết, dẫn đến nguy cơ âm tính giả, đặc biệt với các mẫu có giá trị Ct cao 33 đến 35 trở lên.
• Để giảm hiểu sai sót gây âm tính giả đó chính là hạn chế gộp mẫu, ưu tiên gộp từ 5 mẫu trở xuống để đảm bảo độ nhạy. Với các mẫu nghi ngờ, nên xét nghiệm riêng lẻ để tránh bỏ sót ca bệnh.

Hóa Chất Tách Chiết Không Đảm Bảo

• Nguyên nhân của Carrier RNA đây là thành phần quan trọng trong tách chiết RNA, ví dụ: Qiagen RNA extraction kit nếu để lâu hoặc bảo quản không đúng tan đông nhiều lần, không chia aliquot nhỏ, không cất ở -20°C sẽ làm giảm hiệu suất thu hồi RNA, dẫn đến âm tính giả.
• Giải pháp đó chính là tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất: hoàn nguyên carrier RNA và cho ngay vào lysis buffer AVL, hoặc chia aliquot nhỏ và bảo quản ở -20°C.
  Tách chiết cùng chứng nội tại EAV virus RNA từ hải cẩu để kiểm tra hiệu suất tách chiết. Nếu chứng nội tại cho kết quả tốt, quy trình tách chiết được đảm bảo.

Nhầm Buffer Trong Tách Chiết Tay

• Nguyên nhân chính từ kỹ thuật viên mới dễ nhầm thứ tự buffer cồn, AW1, AW2 hoặc quên thêm cồn vào AW1 hoặc AW2, đặc biệt khi tách chiết nhiều mẫu hoặc sử dụng đồng thời kit cũ và kit mới. Dồn buffer thừa từ các kit dẫn đến nhầm lẫn giữa lọ cũ và lọ mới.
• Giải pháp loại bỏ âm tính giả trong chiết tay bằng cách sử dụng hết vật tư của kit cũ trước khi chuyển sang kit mới, bỏ buffer thừa để tránh nhầm lẫn. Đánh dấu lọ buffer đã thêm cồn và ghi ngày mở lọ. Đào tạo kỹ thuật viên cẩn thận về quy trình tách chiết.

Tách Chiết Hệ Thống Tự Động

Nguyên nhân từ các hệ thống tự động (như Magna Pure 96, Magna 24) sử dụng bi từ để thu RNA, nhưng hiệu suất thường không bằng tách tay, dẫn đến nguy cơ âm tính giả nếu không kiểm soát chất lượng.

Giải pháp bằng cách chiết cùng chứng nội tại và chạy PCR để đảm bảo chất lượng. Kiểm tra định kỳ thiết bị và hóa chất của hệ thống tự động.

Tra Mẫu Bỏ Sót Hoặc Thiếu Thể Tích

Nguyên nhân là khi tra 5 đến 10 µl RNA khuôn mẫu vào master mix, nếu sử dụng pipette đơn kênh cho nhiều mẫu hoặc làm vào ban đêm khi kỹ thuật viên mệt mỏi, dễ dẫn đến bỏ sót hoặc hút thiếu thể tích, gây âm tính giả.

Giải pháp khắc phục đó là sử dụng pipette đa kênh khi tách chiết tự động để giảm sai sót. Phân công hai người kiểm tra khi tra mẫu, đặc biệt với mẫu tách tay. Hạn chế chạy mẫu đêm để tránh nhầm lẫn do mệt mỏi.

3. Sau Xét Nghiệm

Chỉnh Baseline Quá Cao

Nguyên nhân là một số máy PCR cho phép chỉnh baseline (đường nền), nhưng nếu chỉnh quá cao, các mẫu dương tính yếu có thể bị chuyển thành âm tính.

Tham khảo thêm về Máy PCR Chẩn đoán nhanh trong sinh học phân tử

Giải pháp chính là giữ giá trị huỳnh quang baseline trong khoảng 300-500 để tránh nhiễu. Xem xét từng đồ thị của mẫu nghi ngờ và chạy lại nếu cần. Thay probe mới nếu tín hiệu nền quá nhiễu do probe để lâu, tan đông nhiều lần, hoặc không được quấn giấy bạc (gây đứt gãy reporter, tăng huỳnh quang nền).

Gene Đích Khác Nhau Gây Khó Khăn Trong Nhận Định

Nguyên nhân do Gene E thường dương tính trong khi gene RdRp âm tính do RdRp kém nhạy hơn. Theo quy trình WHO, gene E dương tính rõ có thể kết luận ca bệnh, nhưng vẫn có nguy cơ dương tính giả.

Giải pháp là chạy thêm các gene khác (N hoặc Orf1ab) để khẳng định kết quả. Nếu vẫn nghi ngờ, sử dụng phương pháp xét nghiệm khác hoặc lấy mẫu lại. Tầm

Quan Trọng Của Việc Kiểm Soát Âm Tính Giả trong PCR

Âm tính giả trong PCR có thể dẫn đến bỏ sót ca bệnh, gây nguy cơ lây lan dịch bệnh trong cộng đồng. Việc kiểm soát các nguyên nhân gây âm tính giả giúp:

• Tăng độ chính xác: Đảm bảo phát hiện đúng các ca nhiễm SARS-CoV-2.
• Hỗ trợ truy vết hiệu quả: Giúp khoanh vùng và dập dịch nhanh chóng.
• Tiết kiệm nguồn lực: Tránh xét nghiệm lặp lại không cần thiết và tối ưu hóa công tác chống dịch.

Xét nghiệm PCR là công cụ quan trọng trong chẩn đoán covid 19, nhưng âm tính giả trong xét nghiệm PCR có thể xảy ra do nhiều yếu tố như chất lượng bệnh phẩm, thời điểm lấy mẫu, môi trường bảo quản, hoặc sai sót trong quy trình tách chiết và xét nghiệm.

Để giảm thiểu nguy cơ này, các phòng xét nghiệm cần sử dụng môi trường VTM tiêu chuẩn (Standard Viral Transport Medium), đào tạo kỹ thuật viên lấy mẫu và tách chiết đúng quy trình, sử dụng chứng nội tại, và kiểm soát chặt chẽ các bước từ lấy mẫu đến phân tích kết quả. Những nỗ lực này không chỉ nâng cao chất lượng xét nghiệm mà còn góp phần quan trọng vào thành công của chiến lược phòng chống đại dịch COVID-19.
Nếu bạn cần thêm thông tin về xét nghiệm PCR hoặc các biện pháp phòng chống COVID-19, hãy liên hệ với các cơ sở y tế uy tín để được tư vấn chi tiết!