Định Lượng Tương Đối Real Time PCR

Giới Thiệu Về Định Lượng Tương Đối Real Time PCR

Định lượng tương đối real time PCR là một phương pháp quan trọng trong sinh học phân tử, được sử dụng để đo lường mức độ biểu hiện của gene hoặc xác định tỷ lệ nhiễm tác nhân gây bệnh khi không thể xác định chính xác khối lượng mẫu thử.

Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong các nghiên cứu như phát hiện virus trên tôm sú, phân tích biểu hiện gene trong ung thư, hoặc đánh giá sản phẩm biến đổi gene.

Vậy Định Lượng Tương Đối Là Gì?

Định lượng tương đối được áp dụng khi không thể đo lường chính xác khối lượng mẫu thử,

ví dụ như xác định mức độ biểu hiện gene trong mô ung thư.

Phương pháp này khắc phục hạn chế của định lượng tuyệt đối, khi lượng mẫu thử không đồng nhất có thể làm sai lệch kết quả.

Tìm hiểu thêm về: Định lượng tuyệt đối real time PCR

Định lượng tương đối so sánh mức độ biểu hiện gene hoặc tác nhân đích giữa mẫu thử và mẫu chứng, dựa trên các thông số như chu kỳ ngưỡng Ct trong real time PCR.

Ứng Dụng Của Định Lượng Tương Đối

• Nghiên cứu ung thư: Định lượng biểu hiện gene, ví dụ: gene P53 trong tế bào ung thư so với tế bào bình thường.
• Phát hiện tác nhân gây bệnh: Xác định tỷ lệ nhiễm virus như virus gây bệnh trên tôm sú.
• Nghiên cứu sản phẩm biến đổi gene: Đánh giá mức độ biểu hiện của gene được chỉnh sửa.

Các Phương Pháp Định Lượng Tương Đối Real-Time PCR

1. Định Lượng Tương Đối Dựa Trên Đơn Vị Khối Lượng Unit Mass

Phương pháp này yêu cầu xác định chính xác lượng mẫu thử (tế bào, nucleic acid tách chiết). Ví dụ, để so sánh biểu hiện gene P53 trong tế bào có thử chất gây ung thư X và tế bào chứng:

• Chuẩn bị hai lô tế bào cùng điều kiện, một lô thử chất X, một lô không thử.
• Tách chiết RNA từ cả hai lô, lấy cùng lượng RNA (ví dụ: 50 ng).
• Thực hiện real-time PCR với mồi đặc hiệu cho mRNA của P53.
• Ghi nhận chu kỳ ngưỡng:
  • Ct[T]: Chu kỳ ngưỡng của P53 trong mẫu thử (có chất X).
  • Ct[C]: Chu kỳ ngưỡng của P53 trong mẫu chứng (không có chất X).

Nếu hiệu quả PCR đạt 100% (E = 2), tỷ lệ biểu hiện gene P53 được tính bằng công thức:

Tỷ lệ biểu hiện = 2^(Ct[C] – Ct[T])

Ví dụ: Nếu Ct[T] = 12 và Ct[C] = 15, thì tỷ lệ biểu hiện là 2^(15-12) = 2^3 = 8, nghĩa là chất X làm tăng biểu hiện P53 gấp 8 lần.

2. Định Lượng Tương Đối Dựa Trên Gene Tham Chiếu Reference Gene

Phương pháp này sử dụng một gene tham chiếu (reference gene) có biểu hiện ổn định giữa các mẫu thử và mẫu chứng. Hai phương pháp phổ biến là:

a. Phương Pháp 2^(-ΔΔCt) Của Livak

Phương pháp này thường được sử dụng để so sánh biểu hiện gene trong các mẫu khác nhau (ví dụ: tế bào ung thư so với tế bào bình thường). Các bước thực hiện:

Định lượng cả gene đích (Tg) và gene tham chiếu (Ref) trong mẫu thử (T) và mẫu chứng (C).

Ghi nhận các giá trị chu kỳ ngưỡng:

• Ct(T/Tg): Chu kỳ ngưỡng của gene đích trong mẫu thử.
• Ct(T/Ref): Chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu trong mẫu thử.
• Ct(C/Tg): Chu kỳ ngưỡng của gene đích trong mẫu chứng.
• Ct(C/Ref): Chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu trong mẫu chứng.

Tính ΔCt cho mỗi mẫu:

• ΔCt(T) = Ct(T/Tg) – Ct(T/Ref)
• ΔCt(C) = Ct(C/Tg) – Ct(C/Ref)

Tính ΔΔCt = ΔCt(T) – ΔCt(C).

Tính tỷ lệ biểu hiện: R = 2^(-ΔΔCt) (nếu hiệu quả PCR đạt 100%).

Ví dụ: Định lượng gene P53 trong tế bào ung thư buồng trứng (T) so với tế bào bình thường (C), sử dụng gene tham chiếu GAPDH:

Đây là chu kỳ ngưỡng của gene P53 (Tg) và GADPH (Ref) của hai mẫu cấy tế bào buồng trứng ung thư (T) và bình thường (C)

Với bảng trên chúng ta có thể Tính toán:

• ΔCt(T) = 12.0 – 15.9 = -3.9
• ΔCt(C) = 15.0 – 16.5 = -1.5
• ΔΔCt = -3.9 – (-1.5) = -2.4
• R = 2^(-(-2.4)) = 2^2.4 ≈ 5.3

Kết luận: Gene P53 biểu hiện cao gấp 5.3 lần trong tế bào ung thư so với tế bào bình thường.

b. Phương Pháp Pfaffl

Phương pháp Pfaffl được sử dụng khi hiệu quả PCR của gene đích (E[Tg]) và gene tham chiếu (E[Ref]) không đạt 100%. Công thức tổng quát:

R = E(Tg)^(ΔCt(C/Tg-T/Tg)) / E(Ref)^(ΔCt(C/Ref-T/Ref))

Nếu E(Tg) = E(Ref) = 2, công thức sẽ trở về dạng 2^(-ΔΔCt) như phương pháp Livak.

Ví dụ: Với dữ liệu như trên và E = 2, tính toán cho ra R = 2^(15-12) / 2^(16.5-15.9) ≈ 5.3, tương tự kết quả của Livak.

3. Định Lượng Tương Đối Dựa Trên Khối Lượng Vật Chủ

Phương pháp này thường được sử dụng để xác định tỷ lệ nhiễm virus (như virus GAV trên tôm sú) mà không cần xác định chính xác khối lượng mẫu thử. Các bước thực hiện:

• Tách chiết RNA từ mẫu tôm, tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên.
• Thực hiện real-time PCR với hai hệ thống:
  • Hệ thống thử: Định lượng gene đặc hiệu của virus (Ct[GAV]).
  • Hệ thống tham chiếu: Định lượng gene của vật chủ (như cytochrome b, Ct[Cytob]).
• Tính tỷ lệ nhiễm virus: IP = Ct[GAV] / Ct[Cytob].

Ví dụ: Sử dụng bộ thử nghiệm RT qPCR của công ty Nam Khoa để định lượng virus GAV:

• Tách chiết RNA từ mẫu tôm, tổng hợp cDNA.
• Thực hiện real-time PCR với Taqman probe đặc hiệu cho GAV và cytochrome b.
• Kết quả: Tỷ lệ Ct[GAV] / Ct[Cytob] cho biết mức độ nhiễm virus GAV trong mẫu.

Định lượng tương đối real time PCR là một công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu sinh học phân tử, cho phép so sánh mức độ biểu hiện gene hoặc tỷ lệ nhiễm tác nhân gây bệnh một cách chính xác và đáng tin cậy.

Tìm hiểu thiết bị real time PCR tại đây: máy PCR

Các phương pháp như định lượng dựa trên đơn vị khối lượng, gene tham chiếu Livak, Pfaffl, hoặc khối lượng vật chủ đều có những ứng dụng cụ thể, phù hợp với từng loại mẫu thử và mục tiêu nghiên cứu.

Việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ giúp tối ưu hóa kết quả và đảm bảo độ chính xác trong phân tích.