Định lượng tuyệt đối khi ứng dụng Real time PCR

Định lượng tuyệt đối real time PCR là gì?

Định lượng tuyệt đối real time PCR là phương pháp được sử dụng để xác định chính xác số lượng copies của tác nhân đích DNA hoặc RNA trong mẫu thử hoặc bệnh phẩm.

Phương pháp này đặc biệt quan trọng trong các xét nghiệm y học, chẳng hạn như định lượng HBV virus viêm gan B, HCV viêm gan C, hoặc HIV trong máu để đánh giá hiệu quả điều trị.

Để thực hiện định lượng tuyệt đối, kỹ thuật viên vận hành máy PCR cần biết chính xác thể tích hoặc khối lượng của mẫu thử, đồng thời sử dụng biểu đồ chuẩn để tính toán.

Vai trò của biểu đồ chuẩn trong định lượng tuyệt đối

Biểu đồ chuẩn là yếu tố cốt lõi trong định lượng tuyệt đối real time PCR.

Nó thể hiện mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng Ct và log10 của số lượng copies DNA đích ban đầu trong ống phản ứng.

Dựa vào biểu đồ chuẩn, chương trình của máy real-time PCR sẽ tính toán hàm lượng DNA đích ban đầu trong mẫu.

Cụ thể, biểu đồ chuẩn cung cấp một hàm số tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa:

Y = Ct (chu kỳ ngưỡng)

X = log10(Sq) (log10 của số lượng bản DNA đích ban đầu)

Hàm số này có dạng: Y = [slope × X] + intercept

Trong đó:

Slope: Độ dốc của đường chuẩn, thể hiện mối quan hệ giữa Ct và log10(Sq).

Intercept: Giao điểm của đường chuẩn với trục Y.

Từ hàm số trên, máy real-time PCR sẽ tính số lượng copies DNA đích (Sq) theo công thức:
Sq = 10^[(Ct – intercept)/slope]

Quy trình thực hiện định lượng tuyệt đối

1. Chuẩn bị mẫu: Xác định chính xác thể tích hoặc khối lượng mẫu thử. Tách chiết DNA/RNA từ mẫu bằng phương pháp phù hợp, lưu ý hệ số tách chiết để đảm bảo tính chính xác.
2. Chạy real-time PCR: Thực hiện xét nghiệm real-time PCR trên mẫu thử cùng với các mẫu chuẩn có số lượng copies DNA đã biết trước.
3. Xây dựng biểu đồ chuẩn: Dựa trên các mẫu chuẩn, máy sẽ tạo ra đường biểu diễn chuẩn, xác định mối quan hệ giữa Ct và số lượng copies DNA.
4. Tính toán số copies: Sử dụng công thức Sq = 10^[(Ct – intercept)/slope] để tính số lượng copies DNA đích trong ống phản ứng.
5. Điều chỉnh kết quả: Kết hợp hệ số pha loãng mẫu và hệ số tách chiết DNA/RNA để xác định chính xác số copies của tác nhân đích trong mẫu thử hoặc bệnh phẩm.

Ứng dụng của định lượng tuyệt đối

Phương pháp định lượng tuyệt đối real-time PCR được sử dụng rộng rãi trong:

• Chẩn đoán và theo dõi điều trị: Định lượng virus như HBV, HCV, HIV để đánh giá hiệu quả điều trị.
• Nghiên cứu khoa học: Xác định số lượng bản sao của gen mục tiêu trong các thí nghiệm sinh học phân tử.
• Kiểm soát chất lượng: Đảm bảo độ chính xác trong các xét nghiệm chẩn đoán.

Lưu ý để đạt kết quả chính xác trong định lượng tuyệt đối Real time PCR

• Mẫu chuẩn: Cần sử dụng các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết và được xác nhận để xây dựng biểu đồ chuẩn chính xác.
• Hệ số pha loãng: Đảm bảo ghi nhận và tính toán đúng hệ số pha loãng của mẫu.
• Máy real-time PCR: Cần được hiệu chuẩn thường xuyên để đảm bảo kết quả đáng tin cậy.
• Kỹ thuật tách chiết: Sử dụng phương pháp tách chiết DNA/RNA phù hợp để giảm thiểu sai số.

Định lượng tuyệt đối real time PCR là một công cụ mạnh mẽ trong y học và nghiên cứu sinh học phân tử, giúp xác định chính xác số lượng copies của DNA/RNA đích trong mẫu thử.

Với sự hỗ trợ của biểu đồ chuẩn và các công thức tính toán, phương pháp này mang lại kết quả đáng tin cậy, hỗ trợ hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị.

Để đạt kết quả tối ưu, cần đảm bảo quy trình thực hiện đúng kỹ thuật và sử dụng thiết bị đạt chuẩn.

Tìm hiểu thiết bị PCR đạt chuẩn: Máy PCR