Kỹ thuật Real Time PCR và tổng hợp các thuật ngữ cần biết

Kỹ thuật Real Time PCR Là Gì?

Trong sinh học phân tử có kỹ thuật Real time PCR, hay còn gọi là PCR định lượng thời gian thực, đây là một phiên bản nâng cấp vượt trội so với PCR truyền thống. Real time PCR cho phép bạn theo dõi quá trình khuếch đại DNA hoặc RNA ngay khi phản ứng đang diễn ra, chứ không phải chờ đến lúc xong mới biết kết quả.

Có thể bạn tìm hiểu thêm về Thiết bị PCR: Máy PCR Chẩn đoán nhanh trong sinh học phân tử

Cách hoạt động của kỹ thuật này là dùng Enzyme để nhân bản một đoạn DNA cụ thể lên hàng ngàn, thậm chí hàng triệu bản sao ngay trong ống nghiệm, với các nguyên liệu xúc tác cần thiết như DNA mẫu, primer, nucleotide dNTPs, và enzyme polymerase bền nhiệt.

So với phương pháp PCR truyền thống thì real time PCR nhanh hơn, chuẩn xác hơn, và nhạy hơn rất nhiều. Điểm đặc biệt là nó giúp bạn dễ dàng tính toán mối liên hệ giữa lượng DNA ban đầu và sản phẩm khuếch đại gọi là amplicon ở từng chu kỳ một, rất hữu ích cho việc đo lường chính xác axit nucleic:

Ví dụ như kiểm tra biểu hiện gen hay xác định số lượng virus trong mẫu bệnh. Thêm nữa, nó loại bỏ việc phải xử lý sau phản ứng, giảm nguy cơ lây nhiễm chéo từ các mẫu phẩm cũ, đây được coi là bước độ phá mới mẻ cho việc phát hiện và đo lường axit nucleic trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Nhưng để hiểu cơ bản về Real Time PCR ra sao chúng ta cần phải biết các thuật ngữ trong Real Time PCR được nêu ra bên dưới.

Các thuật ngữ thường gặp trong Real Time PCR

Baseline (Đường Nền)

Baseline trong Real-time PCR là mức tín hiệu huỳnh quang ghi nhận trong các chu kỳ đầu của phản ứng, thường từ chu kỳ 3 đến 15, khi tín hiệu thay đổi không đáng kể. Đây được xem là tín hiệu nền hoặc “nhiễu” của phản ứng, phản ánh mức huỳnh quang không đặc hiệu. Việc xác định chính xác baseline rất quan trọng để tính toán chu kỳ ngưỡng (Ct) một cách đáng tin cậy. Baseline thường được thiết lập tự động bởi phần mềm của máy Real-time PCR hoặc do người dùng phân tích dựa trên đồ thị khuếch đại. Để đảm bảo kết quả chính xác, baseline cần được thiết lập sao cho không bao gồm các chu kỳ mà tín hiệu khuếch đại đã bắt đầu tăng, tránh sai lệch trong phân tích Real-time PCR.

Threshold (Ngưỡng)

Threshold là mức tín hiệu huỳnh quang được xác định để phân biệt tín hiệu khuếch đại thực sự với tín hiệu nền trong Real-time PCR. Ngưỡng thường được đặt ở mức 10 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu tại baseline, nằm trong pha lũy thừa của phản ứng. Người dùng có thể điều chỉnh ngưỡng để phù hợp với từng thí nghiệm, nhưng cần đảm bảo tính nhất quán khi so sánh giữa các phản ứng khác nhau. Việc đặt ngưỡng đúng giúp xác định giá trị Ct chính xác, từ đó đảm bảo độ tin cậy của kết quả định lượng trong Real-time PCR.

Chu Kỳ Ngưỡng (Ct)

Chu kỳ ngưỡng (Ct) là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua ngưỡng đã thiết lập. Trong Real-time PCR, giá trị Ct tỷ lệ nghịch với lượng DNA hoặc RNA ban đầu trong mẫu: mẫu có nhiều DNA sẽ có Ct thấp hơn, trong khi mẫu với ít DNA sẽ có Ct cao hơn. Ví dụ, nếu một mẫu có lượng DNA gấp đôi mẫu khác, Ct của mẫu đó sẽ thấp hơn khoảng 1 chu kỳ, giả định hiệu suất phản ứng đạt 100%. Ct là yếu tố cốt lõi để định lượng DNA/RNA trong Real-time PCR, được sử dụng trong cả định lượng tuyệt đối và tương đối.

Tìm hiểu thêm về: Kỹ thuật xử lý và phân tích dữ liệu Realtime PCR

Đường Chuẩn (Standard Curve)

Đường chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng một dãy pha loãng của mẫu chuẩn với nồng độ đã biết. Trong Real-time PCR, logarit của nồng độ mẫu chuẩn (trục X) được vẽ đối chiếu với giá trị Ct (trục Y). Đường chuẩn giúp xác định lượng DNA/RNA ban đầu trong mẫu thí nghiệm và đánh giá hiệu suất của phản ứng. Các thông số như độ dốc (slope), tung độ gốc (y-intercept), và hệ số tương quan (R²) được lấy từ đường chuẩn, cung cấp thông tin quan trọng để phân tích kết quả Real-time PCR.

Hệ Số Tương Quan (R²)

Hệ số tương quan (R²) thể hiện mức độ phù hợp của dữ liệu với đường chuẩn trong Real-time PCR. Giá trị R² lý tưởng là 1, nhưng trong thực tế, giá trị tối đa thường đạt khoảng 0,999. Một R² cao cho thấy đường chuẩn đáng tin cậy, đảm bảo kết quả định lượng chính xác. Trong phân tích Real-time PCR, R² là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng của đường chuẩn và độ chính xác của thí nghiệm.

Tung Độ Gốc (Y-intercept)

Tung độ gốc (Y-intercept) là giá trị Ct dự kiến khi nồng độ mẫu đạt mức thấp nhất có thể phát hiện được trong Real-time PCR. Mặc dù lý thuyết cho rằng Real-time PCR có thể phát hiện một bản sao DNA, nhưng giới hạn định lượng đáng tin cậy thường nằm trong khoảng 2–10 bản sao. Y-intercept được sử dụng để so sánh hiệu suất giữa các hệ thống Real-time PCR khác nhau, giúp đánh giá độ nhạy và tính ổn định của phản ứng.

Pha Lũy Thừa (Exponential Phase)

Pha lũy thừa là giai đoạn trong phản ứng Real-time PCR mà tại đó sản phẩm DNA tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Đây là giai đoạn lý tưởng để thực hiện định lượng, vì các tác nhân phản ứng như primer, dNTP, và enzyme polymerase còn đầy đủ, đảm bảo hoạt động hiệu quả. Phân tích trong pha lũy thừa giúp dữ liệu Real-time PCR chính xác hơn, tránh sai lệch do cạnh tranh primer hoặc cạn kiệt tác nhân ở các giai đoạn sau.

Độ Dốc (Slope)

Độ dốc (slope) của đường chuẩn trong pha log-linear phản ánh hiệu suất phản ứng Real-time PCR. Hiệu suất lý tưởng 100% tương ứng với độ dốc khoảng -3,32. Độ dốc được sử dụng để tính hiệu suất phản ứng theo công thức:
Hiệu suất (Efficiency) = 10^(-1/slope) – 1
Hiệu suất thực tế thường dao động từ 90% đến 110%, tương ứng với độ dốc từ -3,58 đến -3,10. Các yếu tố như chiều dài amplicon, cấu trúc bậc hai của DNA, hàm lượng GC, hoặc chất ức chế có thể ảnh hưởng đến hiệu suất Real-time PCR.

Khoảng Động (Dynamic Range)

Khoảng động là phạm vi nồng độ mẫu đầu vào mà tại đó tín hiệu khuếch đại thay đổi tương ứng trong Real-time PCR. Khoảng động lý tưởng là 7–8 bậc số mười đối với plasmid DNA và 3–4 log đối với cDNA hoặc DNA hệ gen. Một khoảng động rộng đảm bảo khả năng định lượng chính xác trong các mẫu có nồng độ khác nhau, là yếu tố quan trọng trong các ứng dụng của Real-time PCR.

Định Lượng Tuyệt Đối (Absolute Quantification)

Định lượng tuyệt đối là phương pháp sử dụng đường chuẩn từ các mẫu có nồng độ đã biết để xác định nồng độ DNA/RNA trong mẫu chưa biết. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong Real-time PCR để xác định số lượng bản sao chính xác, đặc biệt trong chẩn đoán vi khuẩn, virus, hoặc các nghiên cứu cần độ chính xác cao.

Định Lượng Tương Đối (Relative Quantification)

Định lượng tương đối so sánh mức biểu hiện của gen mục tiêu giữa hai mẫu, chẳng hạn mẫu xử lý và mẫu đối chứng, trong Real-time PCR. Kết quả được biểu thị dưới dạng fold change (tăng hoặc giảm). Một gen tham chiếu như β-actin được sử dụng để chuẩn hóa, giúp loại bỏ biến động kỹ thuật và đảm bảo độ tin cậy của kết quả Real-time PCR.

Đường Cong Nóng Chảy (Melting Curve)

Đường cong nóng chảy được tạo ra bằng cách phân tích sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang khi DNA mạch kép (dsDNA) tách thành DNA mạch đơn (ssDNA) do tăng nhiệt độ. Trong Real-time PCR sử dụng thuốc nhuộm như SYBR® Green I, khi DNA tách mạch tại nhiệt độ nóng chảy (Tm), tín hiệu huỳnh quang giảm đột ngột. Phân tích đường cong nóng chảy giúp phát hiện các sản phẩm không đặc hiệu như primer-dimer, đảm bảo tính đặc hiệu của phản ứng Real-time PCR mà không cần chạy điện di gel.

 

Hiểu rõ các thuật ngữ như baseline, threshold, Ct, đường chuẩn, R², y-intercept, pha lũy thừa, độ dốc, hiệu suất, khoảng động, định lượng tuyệt đối, định lượng tương đối, và đường cong nóng chảy là nền tảng để sử dụng hiệu quả công nghệ Real-time PCR.

Có thể bạn muốn tìm hiểu thêm: Hiểu về Biểu Đồ Khuếch Đại PCR để test chuẩn xác

Những khái niệm này không chỉ giúp phân tích dữ liệu chính xác mà còn tối ưu hóa quy trình thí nghiệm, đảm bảo kết quả chuẩn xác trong nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn. Với tính ứng dụng cao trong y học, sinh học, và kiểm tra an toàn thực phẩm, Real time PCR tiếp tục là một công cụ không thể thiếu trong xét nghiệm y học hiện đại.